加味二仙丸对支气管哮喘大鼠钙离子通道的影响*

杨美莹，沈 枭，符 艳，王 伟，李 妲，肖雪飞，赵四林

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

支气管哮喘（bronchial asthma，BA）是以反复发作性喘息、胸闷或咳嗽等为主要临床表现的一种呼吸道慢性炎症性疾病[1]。平滑肌收缩、上皮细胞脱落、黏液分泌过多、气道炎症、支气管高反应性和黏膜水肿都是哮喘的潜在病理生理学因素[2]。被钙库操控的钙离子通道（store-operated calcium channel，SOCC）是胞外钙离子进入细胞内的重要通道之一，因肌/内质网中储存的钙离子耗竭从而被激活，其通过钙离子传感器基质相互作用分子1（stromal Interaction Molecule 1，STIM1）与质膜SOCC通信[3-4]。位于细胞膜上钙释放激活钙通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）被认为是质膜中SOCC的主要成孔亚基，单独的ORAI蛋白可以形成高度钙离子选择性的SOCC通道。钙释放激活的SOCC由STIM1和ORAI1蛋白介导，在多种细胞中形成主要的钙池操纵的胞外钙离子内流（store-operated calcium entry，SOCE）通路[5-6]。有研究表明SOCE对细胞的兴奋性与收缩性有影响，在支气管哮喘的发生发展过程中起着重要作用[7-8]。但有关SOCE在BA病情发生发展过程中的作用及其相关机制在国内外研究不多。加味二仙丸是湖南中医药大学第一附属医院范伏元教授经验方，全方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、五味子、蛤蚧组成，具有补肺益肾、纳气定喘之功。临床上加味二仙丸治疗支气管哮喘每获良效。因此，本研究建立大鼠哮喘模型，试图从SOCC探讨加味二仙丸治疗BA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄健康SPF级雄性SD大鼠54只，体质量（110±10）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物合格证号：430727 211101137434。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级动物房，温度为24～26 ℃，相对湿度为50%～70%，照明以12 h/12 h明暗交替循环，自由进食饮水，分笼喂养，适应性饲养4～5 d后进行实验。动物饲养符合湖南省动物实验管理条例，实验对动物的各种处理均遵守动物使用及伦理学规定。麻醉处死全部实验大鼠，本实验已通过本院实验动物伦理审查（ZYFY20 220513-17）。

1.2 药物与试剂 加味二仙丸，方药组成：仙茅30 g，淫羊藿30 g，巴戟天15 g，五味子15 g，蛤蚧粉15 g。总生药量为105 g，由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供。所有药材均经鉴定符合《中华人民共和国药典》规定，按《中华人民共和国药典》要求制备煎煮液，按含生药0.945 g/mL配制成加味二仙丸汤剂冷藏备用；固肾定喘丸（批号：Z44020906）购自广州敬修堂（药业）股份有限公司；鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（批号：516V064）购自Solarbio公司；磷酸盐平衡液（PBS）（批号：023K2321）、氢氧化铝粉（批号：023A5431）均购自美国Sigma公司；STIM1一抗抗体（批号：10013327）购自美国proteintech公司；ORAI1一抗抗体（批号：35y4419）购自affinity公司；GAPDH鼠单抗（批号：B7401）购自Immunoway公司；苏木素（批号：ZP7635BP35）、伊红（批号：ZP6459BP59）、中性树胶（批号：ZP5247BP47）均购自BOSTER公司；病理组织切片石蜡（批号：062521211105）购自德国莱卡有限公司；双抗（青链霉素）（批号：ST635）、胰酶消化液（批号：P0012B）、Fluo-3AM荧光指示剂（批号：011020211201）均购自碧云天公司；胎牛血清（FBS）（批号：42A0378K）购自美国Gibco公司；山羊血清工作液（批号：20211204）购自百奥莱博公司。

1.3 主要仪器 L3660D型台式低速离心机（上海知信实验室仪器技术有限公司）；RM2016型病理切片机（德国徕卡公司）；DSY2000X型倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器公司）；DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪（北京六一仪器厂）；DXFLEX型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；WH210型加热磁力搅拌器（德国WIGGENS公司）；DH-160I型直热式二氧化碳培养箱（上海三藤仪器公司）。

1.4 造模与分组 将54只SD大鼠进行编号标记，采用随机数字表法分成空白组9只，造模组45只。参照文献[9]的方法，造模组大鼠分别在第1天、第8天、第15天无菌腹腔注射10%卵清蛋白（OVA）溶液1 mL（含100 mg OVA和100 mg氢氧化铝）致敏，而空白组大鼠用生理盐水进行腹腔注射；造模组大鼠于第16天起雾化吸入含有1% OVA的生理盐水1 mL，每次30 min，1次/d，共7 d，以激发哮喘，而空白组大鼠用生理盐水进行雾化吸入，吸入时间保持一致。雾化结束后，空白组随机选取3只大鼠、造模组随机选取15只大鼠，取肺组织做病理切片行HE染色。若大鼠出现烦躁、搔鼻、呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及四肢瘫软等表现，且肺组织病理切片HE染色表现为气道大量炎症细胞浸润，支气管黏膜上皮肿胀、成片脱落，部分肺泡间隔增厚，支气管痉挛等，即证明造模成功[10]。造模成功后将造模组大鼠按随机数字表法分成模型组、固肾定喘丸组、加味二仙丸低剂量组、加味二仙丸中剂量组、加味二仙丸高剂量组，每组6只。

1.5 实验给药 动物给药剂量利用大鼠与人临床用药剂量、体型系数公式dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3换算[11]得出，加味二仙丸低、中、高剂量组大鼠灌胃给予加味二仙丸溶液，剂量分别为4.725、9.450、18.900 g/（kg·d)；固肾定喘丸组大鼠灌胃给予固肾定喘丸溶液，剂量为0.540 g/（kg·d)；模型组和空白组大鼠予以等体积的生理盐水灌胃；每只大鼠灌胃体积为10 mL/kg，2次/d，连续给药28 d。

1.6 观察指标

1.6.1 HE染色检测肺组织病理变化 将浸入4%多聚甲醛溶液固定的新鲜肺组织，按先后依次经过从低至高浓度的酒精脱水、浸蜡包埋、切片与贴片。将组织切片置于载玻片上，使用试剂盒进行HE染色，封片后置于显微镜下观察肺组织病理变化情况。

1.6.2 免疫组织化学法检测STIM1、ORAI1的蛋白表达水平 将肺组织切片放在90 ℃恒温箱中烘烤、常规脱蜡、复水、抗原修复、PBS冲洗，加正常山羊血清工作液（稀释）封闭。4 ℃孵育一抗（1∶20）12 h，37 ℃孵育二抗0.5 h，冲洗后加DAB显色液，苏木精染细胞核，最后脱水、中性树胶封片，采用彩色病理图文分析系统测定STIM1蛋白和ORAI1蛋白阳性细胞的平均光密度值。

1.6.3 Western blotting法测定STIM1和ORAI1的蛋白相对表达量 常规提取细胞总蛋白；蛋白电泳，转膜；分别加入GAPDH鼠单抗（1∶5 000）、ORAI1兔多抗（1∶1 000）、STIM1兔多抗（1∶2 000）3种一抗，4 ℃下水平摇床过夜。TBST溶液洗膜，加二抗，室温孵育2 h；TBST溶液洗膜后经ECL底物化学发光，暗室胶片显影。采用Scion Image软件（Scion Corporation，Frederick）读取和分析胶片，计算各条带的平均光密度值。

1.6.4 流式细胞仪测定钙离子浓度变化 取肺组织置于15 mL离心管，用眼科剪将组织剪碎至糊状，加入0.25%胰酶5 mL于37 ℃消化30 min（每隔10 min上下颠倒混匀）。加入5 mL完全培养基终止消化，过100 μm滤网，取细胞悬液以800 r/min离心10 min得到细胞沉淀。去掉上清液，加入3 mL红细胞裂解液裂解，PBS清洗细胞2遍后完全培养基重悬细胞备用。用无血清培养液稀释（1∶1 000）离子荧光探针（Fluo-3AM）；以上处理的细胞去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的钙离子染液，加入的体积以能充分盖住细胞为宜；37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除残留的染液；用胰酶消化收集；流式细胞仪检测。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，计量资料符合正态分布者以（）表示，不符合正态分布者用中位数（四分位数）表示。各组间计量资料比较服从正态分布时，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验；数据不服从正态性分布时，采用Kruskal-WallisH检验，进一步两两比较采用Nemenyi法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘模型评估及各组大鼠肺组织病理学改变情况 哮喘模型评估：空白组大鼠无明显呼吸异常；造模组大鼠在第17～23天均有不同程度的打喷嚏、喘息、呼吸急促、烦躁、搔鼻、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸现象。造模组大鼠肺组织HE染色均可见支气管分支及其周围有大量炎症细胞浸润，或可见较多增生的平滑肌组织，管腔内分泌物增多，部分肺泡壁增厚。对照模型评价指标，提示造模成功。

行HE染色后，镜下观察大鼠肺部组织形态。空白组大鼠肺组织及支气管分支形态正常，结构清晰；模型组大鼠支气管分支及其周围有大量以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，尚可见较多增生的平滑肌组织，细支气管管腔内分泌物增多，部分肺泡壁增厚；加味二仙丸低、中、高剂量组和固肾定喘丸组大鼠可见支气管分支及其周围有少量的炎症细胞浸润，管腔内分泌物增多，部分肺泡壁增厚；各给药组大鼠损伤程度介于空白组和模型组之间，且各给药组损伤程度无明显差异。（见图1）

图1 各组大鼠肺组织病理形态（HE，×200）

2.2 各组大鼠肺组织STIM1、ORAI1平均光密度值比较 与空白组比较，模型组大鼠STIM1、ORAI1平均光密度值均明显升高（P＜0.05），加味二仙丸低剂量组STIM1平均光密度值明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，加味二仙丸高剂量组STIM1、ORAI1平均光密度值均明显降低（P＜0.05）。（见表1、图2～3）

表1 各组大鼠肺组织STIM1、ORAI1 平均光密度值比较[M（P25，P75）]

图2 各组大鼠肺组织STIM1 蛋白表达情况（免疫组化，×20）

图3 各组大鼠肺组织ORAI1 蛋白表达情况（免疫组化,×20）

2.3 各组大鼠肺组织STIM1和ORAI1蛋白表达水平比较 与空白组比较，模型组、加味二仙丸低剂量组大鼠肺组织STIM1蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，加味二仙丸高剂量组、固肾定喘丸组大鼠肺组织STIM1蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）。与空白组比较，模型组、加味二仙丸低剂量组、加味二仙丸中剂量组、固肾定喘丸组大鼠肺组织ORAI1蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，加味二仙丸低、中、高剂量组和固肾定喘丸组大鼠肺组织ORAI1蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），且加味二仙丸呈剂量依赖性；加味二仙丸高剂量组大鼠肺组织ORAI1蛋白相对表达量明显低于固肾定喘丸组（P＜0.05）。（见表2～3、图4）

表2 各组大鼠肺组织STIM1 蛋白相对表达量比较[M（P25，P75）]

表3 各组大鼠肺组织ORAI1 蛋白相对表达量比较（）

表3 各组大鼠肺组织ORAI1 蛋白相对表达量比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与加味二仙丸高剂量组比较，cP＜0.05；与固肾定喘丸组比较，dP＜0.05；与加味二仙丸中剂量组比较，eP＜0.05；与加味二仙丸低剂量组比较，fP＜0.05

图4 各组大鼠肺组织STIM1、ORAI1蛋白表达Western blotting 图

2.4 各组大鼠肺组织匀浆中钙离子浓度变化比较 与空白组比较，模型组、加味二仙丸低剂量组大鼠的钙离子平均荧光强度值均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，加味二仙丸高剂量组大鼠的钙离子平均荧光强度值明显降低（P＜0.05），随着加味二仙丸不同剂量组的干预，钙离子平均荧光强度值均有不同程度的减弱，但差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠肺组织匀浆中钙离子平均荧光强度值[M（P25，P75）]

3 讨论

哮喘是最常见、最持久的炎症性气道疾病，影响全世界10%以上的人口。由于支气管狭窄、气道高反应性、血管扩张、气道水肿和感觉神经末梢的刺激，呼吸困难、喘息、胸闷和咳嗽反复发作[12]。哮喘发作时，大量炎症细胞（如肥大细胞和树突细胞）被激活，同时激活的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞在炎症部位积聚，气道上皮细胞和平滑肌细胞等结构细胞释放促进支气管炎症的炎症介质[13]。而在调节支气管相关肌群收缩功能过程中，钙离子发挥着重要作用。因此，在支气管哮喘中，SOCE可能作为肺组织中钙离子调节的重要机制之一，而STIM1与ORAI1结合能产生免疫沉淀，此种结合在钙库耗竭时增加，STIM1与ORAI1结合相互作用是SOCE激活的必需信号[14]。加味二仙丸为湖南中医药大学第一附属医院范伏元教授治疗支气管哮喘缓解期的经验方，全方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、五味子、蛤蚧粉组成，具有补肾益肺、纳气定喘之功。前期我们运用加味二仙丸治疗支气管哮喘缓解期患者，发现加味二仙丸能够减少哮喘患者血清中IL-4、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）的含量，提升患者血清中IFN-γ的水平，减少IgE合成，调节支气管哮喘气道免疫-炎症，维持免疫应答与免疫损伤动态平衡，改善支气管哮喘缓解期患者的肺功能，拮抗炎性介质，消除气道炎症，且加味二仙丸治疗支气管哮喘具有较好的远期疗效[15-16]。本研究发现高剂量加味二仙丸能抑制SOCC重要组成分子STIM1、ORAI1蛋白表达，也能抑制胞外钙离子内流；低、中剂量加味二仙丸能抑制ORAI1的蛋白表达。

SOCC主要是由STIM1和ORAI1组成。STIM1是一种内质网（ER）蛋白，在钙离子动员中起关键作用。由于其作为内质网腔内的钙离子传感器，它可以操控钙离子进入，即SOCE。这是一种钙离子流入途径，涉及真核细胞中的多种信号通路[17]。ORAI1是细胞膜上SOCC组成的亚单位。STIM1蛋白跨越内质网膜，能够感知腔内钙离子浓度，进而负责传递钙离子信号储存及消耗情况，将之反馈到质膜中的成孔ORAI1蛋白中，STIM1和ORAI1的相互作用调控钙离子从细胞外空间重新进入[18]。有研究已证实STIM1和ORAI1介导SOCE参与许多生理病理反应[19]。本实验运用免疫组织化学法和Western blotting法检测肺组织及其周围组织细胞中SOCC重要组成分子STIM1和ORAI1的蛋白阳性细胞数和表达水平，结果表明加味二仙丸高剂量组大鼠STIM1、ORAI1平均光密度值和蛋白表达量均明显低于模型组，加味二仙丸低、中剂量组大鼠ORAI1蛋白表达量均低于模型组，证实加味二仙丸能通过抑制SOCC组成分子的表达，进而抑制SOCE。本实验利用流式细胞仪测定各组大鼠肺组织匀浆中的钙离子平均荧光强度值来反映细胞内钙离子浓度变化。加味二仙丸高剂量组大鼠肺组织匀浆中钙离子浓度明显低于模型组，表明高剂量加味二仙丸能抑制哮喘大鼠的SOCE，进而影响细胞的收缩。

据此，我们认为大鼠肺组织匀浆中存在SOCC，高剂量加味二仙丸能抑制STIM1、ORAI1的平均光密度值和蛋白表达，也能抑制胞外钙离子内流；低、中剂量加味二仙丸能抑制ORAI1的蛋白表达。支气管哮喘以慢性气道炎症为特征，因此控制气道炎症格外重要。钙通道在炎症介质细胞因子的释放、调节气道支气管平滑肌的收缩、气道的重塑等方面作用巨大[20-21]。因此，对气道钙通道的研究有助于更深入地了解哮喘气道炎症、高反应性和重塑的发生、发展，为临床治疗哮喘提供一个新的药物治疗靶点和思路。本实验为加味二仙丸的临床使用提供了依据，有助于加味二仙丸的临床推广，也为进一步探究此方的其他作用机制奠定了基础。