苍耳亭通过ERK/JNK信号通路对溃疡性结肠炎大鼠肠道黏膜组织损伤的影响*

张 瑜，吕小燕

（山西省中医院，山西 太原 030012）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症疾病，主要临床表现为体质量下降、呕吐腹泻、黏液便血等[1]。UC的发病机制暂不明确，大量研究认为是由感染、免疫及遗传等多种因素引起肠黏膜屏障功能受损，造成溃疡[2]，且黏膜损伤不易治愈，反复发作，给人们日常生活与健康带来了严重威胁[3]。目前临床上治疗UC多使用糖皮质激素类生物制剂，虽然这类药物治疗UC效果显著，但其不良反应大且复发率较高[4]。研究表明，中医药可以修复受损肠黏膜[5-6]。苍耳亭是存在于多刺菊科苍耳属植物的一种倍半萜内酯化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗溃疡的作用[7]。MAPK家族成员细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）参与调控机体炎症反应以及免疫应激等多种病理过程，介导肿瘤细胞的增殖与分化[8]。本研究通过建立UC大鼠模型，探究苍耳亭对UC大鼠肠道黏膜的保护作用以及对ERK/JNK信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄SPF级SD雄性大鼠90只，体质量200～220 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。实验过程符合“3R”原则，并得到动物伦理委员会批准，动物伦理审查号：AWE-2019-004。实验前大鼠适应性饲养1周，环境条件为温度22～25 ℃，相对湿度40%～50%，昼夜时长12 h:12 h。

1.2 药物与试剂 2,4,6-三硝基甲苯磺酸（TNBS）（批号：146817）购自临沂艾科化学试剂有限公司；柳氮磺胺吡啶（批号：S0883）购自美国Sigma公司；苍耳亭（批号：C-033）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；IL-6检测试剂盒（批号：SNDR734）、TNF-α检测试剂盒（批号：SND-R635）、IL-10检测试剂盒（批号：SND-R793）均购自滁州仕诺达生物科技有限公司；咬合蛋白（Occludin）（批号：91131S）、紧密连接蛋白1（Claudin-1）（批号：4933S）、Caspase-3（批号：9662S）、p-ERK抗体（批号：5726S）、ERK抗体（批号：4696S）、p-JNK抗体（批号：4668S）、JNK抗体（批号：9252S）、羊抗兔二抗（批号：7074S）、羊抗小鼠二抗（批号：7076S）均购自美国CST公司；HE染色试剂盒（批号：G1120）、DAB显色试剂盒（批号：DA1016）、高效RIPA裂解液（批号：R0010）、BCA蛋白检测试剂盒（批号：PC0020）、ECL发光试剂盒（批号：SW2040）均购自北京索莱宝生物技术公司。

1.3 主要仪器 Contour Elite三维光学显微镜（美国布鲁克公司）；JXFSTPRP-24/32全自动样品快速研磨机（上海净信实业发展有限公司）；Mini P-4小型垂直电泳系统（北京凯元信瑞仪器有限公司）；SIM凝胶成像分析系统（美国Bio-Best公司）。

1.4 模型建立与分组 90只SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、阳性药物组、苍耳亭低剂量组、苍耳亭中剂量组、苍耳亭高剂量组，每组15只。参照文献[9]建立大鼠UC模型：采用5%TNBS与50%乙醇等比例混合配制造模剂混合液。6组大鼠禁食不禁水36 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，采用灌胃针从大鼠肛门插入约8 cm，正常组大鼠给予生理盐水1 mL，其余5组大鼠给予造模剂1 mL。造模完成后，观察大鼠状态变化，出现血便、消瘦、少食、精神沉郁、反应迟钝等表现，提示造模成功[10]。

1.5 实验给药 造模成功后24 h进行给药，阳性药物组大鼠灌胃给予柳氮磺胺吡啶溶液，300 mg/kg[11]；根据《实验动物和动物实验技术》进行给药量计算，参照大鼠与人体表面积等效剂量比值折算，苍耳亭低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予苍耳亭溶液100、200、400 mg/kg，正常组与模型组大鼠给予等体积蒸馏水。1次/d，2 mL/次，连续给药2周。

1.6 观察指标

1.6.1 疾病活动指数（disease activity index,DAI）与结肠黏膜损伤指数（colonic mucosa damage index,CMDI）的评估 记录各组大鼠排出的粪便性状、便血情况和体质量变化，取3项得分的平均数作为DAI评分。治疗结束后处死大鼠，取出完整结肠，进行CMDI评分。DAI与CMDI评分标准见表1。

表1 DAI 与CMDI 评分标准[12-13]

1.6.2 HE染色观察大鼠结肠黏膜病理变化 评分结束后清洗结肠黏膜组织，每组随机取5只大鼠结肠黏膜组织置于多聚甲醛中固定，制备常规石蜡切片，进行HE染色，置于光学显微镜下观察结肠黏膜病理变化。

1.6.3 ELISA法检测结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10含量 评分结束后，每组随机取5只大鼠结肠黏膜组织，按照与PBS溶液1∶9的比例，进行匀浆，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10含量。

1.6.4 免疫组化检测结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3蛋白表达 取制备好的大鼠结肠黏膜组织切片，进行脱蜡水合，采用枸橼酸溶液进行抗原修复，H2O2孵育后，加入山羊血清封闭，清洗后加入Occludin、Claudin-1、Caspase-3一抗，4 ℃孵育，次日加入二抗，室温孵育，采用DAB法显色，再进行冲洗，苏木精复染，封片，显微镜下拍照，采用Image 7.0图像分析软件测定Occludin、Claudin-1、Caspase-3积分光密度值。

1.6.5 Western blotting法检测ERK/JNK信号通路相关蛋白的表达 取剩余大鼠结肠黏膜组织，加入蛋白裂解液，匀浆后提取总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白上样，电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入稀释好的p-ERK、ERK、p-JNK、JNK一抗，4 ℃孵育过夜，加入稀释好的二抗，室温孵育1.5 h，采用ECL发光试剂盒显色，凝胶成像分析系统采集图像并分析灰度值，以GAPDH为内参，计算p-ERK/ERK、p-JNK/JNK。

1.7 统计学方法 采用Graphpad Prism 8.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠DAI与CMDI评分比较 与正常组比较，模型组大鼠DAI与CMDI评分均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组与苍耳亭低、中、高剂量组大鼠DAI与CMDI评分均明显降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，苍耳亭低、中剂量组大鼠DAI与CMDI评分均明显升高（P＜0.05）；苍耳亭高剂量组大鼠DAI与CMDI评分与阳性药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。苍耳亭各剂量组间存在剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠DAI 与CMDI 评分比较（）

表2 各组大鼠DAI 与CMDI 评分比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性药物组比较，cP＜0.05；与苍耳亭低剂量组比较，dP＜0.05；与苍耳亭中剂量组比较，eP＜0.05

2.2 各组大鼠结肠黏膜组织病理变化 正常组大鼠结肠黏膜上皮组织整齐，细胞排列密集，可见杯状隐窝，无病变；模型组大鼠结肠黏膜可见隐窝消失，大量炎症细胞浸润，黏膜下层也出现炎症现象；苍耳亭低剂量组大鼠结肠黏膜上皮组织仍可见一些炎症细胞浸润，未见隐窝；苍耳亭中剂量组大鼠结肠黏膜病变情况减轻，可见隐窝结构，少量炎症细胞浸润；苍耳亭高剂量组与阳性药物组大鼠结肠黏膜组织逐渐趋于正常，可见明显隐窝，未见炎症细胞浸润。（见图1）

图1 各组大鼠结肠黏膜病理切片图（HE，×200）

2.3 各组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10含量比较 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α含量均明显升高（P＜0.05），IL-10含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组和苍耳亭低、中、高剂量组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α含量均明显降低（P＜0.05），IL-10含量明显升高（P＜0.05），且苍耳亭各剂量组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与阳性药物组比较，苍耳亭低、中剂量组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α含量均明显升高（P＜0.05），IL-10含量明显降低（P＜0.05）；苍耳亭高剂量组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10含量与阳性药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10含量比较（）

表3 各组大鼠结肠黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10含量比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性药物组比较，cP＜0.05；与苍耳亭低剂量组比较，dP＜0.05；与苍耳亭中剂量组比较，eP＜0.05

2.4 各组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3表达比较 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1表达明显降低（P＜0.05），Caspase-3表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组和苍耳亭低、中高剂量组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1表达明显升高（P＜0.05），Caspase-3表达明显降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，苍耳亭低、中剂量组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1表达明显降低（P＜0.05），Caspase-3表达明显升高（P＜0.05）；苍耳亭高剂量组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3表达与阳性药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。苍耳亭各剂量组间大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图2、表4）

图2 各组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3 的表达情况（免疫组化，×400）

表4 各组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3 表达水平比较（）

表4 各组大鼠结肠黏膜组织中Occludin、Claudin-1、Caspase-3 表达水平比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性药物组比较，cP＜0.05；与苍耳亭低剂量组比较，dP＜0.05；与苍耳亭中剂量组比较，eP＜0.05

2.5 各组大鼠结肠黏膜组织中ERK/JNK信号通路相关蛋白表达比较 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组和苍耳亭低、中、高剂量组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK均明显降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，苍耳亭低、中剂量组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK均明显升高（P＜0.05）；苍耳亭高剂量组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK与阳性药物组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；苍耳亭各剂量组间结肠黏膜组织p-ERK/ERK、p-JNK/JNK比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见图3、表5）

图3 各组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK蛋白表达Western blotting 图

表5 各组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 的比较（）

表5 各组大鼠结肠黏膜组织中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 的比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性药物组比较，cP＜0.05；与苍耳亭低剂量组比较，dP＜0.05；与苍耳亭中剂量组比较，eP＜0.05

3 讨论

UC是一种严重的肠道炎症性疾病，其发病机制复杂，以结肠黏膜充血、糜烂为主要病理特征[14]。研究[15-16]证实UC的发生与免疫应答紊乱、炎症反应以及肠道黏膜屏障受损有关。研究[17]表明，UC发生时，结肠黏膜组织中炎症反应被持续激活，大量炎症因子如TNF-α、IL-18等分泌，引起肠道黏膜屏障功能被破坏，肠黏膜组织受损。Claudin-1蛋白是一种紧密连接蛋白，能够维护结肠黏膜屏障的完整性和通透性[18]。Occludin蛋白是紧密连接中最重要的结构蛋白，参与紧密连接信号调节[19]。研究[20]表明，Occludin、Claudin-1表达下调，导致结肠黏膜组织通透性增加，结肠黏膜屏障功能受阻，导致UC发生。本研究结果显示，UC模型大鼠DAI与CMDI评分均明显升高，结肠黏膜组织病变严重，结肠黏膜组织中炎症因子IL-6、TNF-α含量明显升高，IL-10含量明显降低，且Occludin、Claudin-1表达明显下调，提示结肠黏膜组织中炎症反应被激活，结肠黏膜屏障功能被破坏，结肠黏膜组织受损，提示UC模型建立成功。

苍耳亭作为一种倍半萜内酯类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[21]。有研究[22]表明，苍耳亭能够通过介导细胞凋亡起到抗肿瘤的作用。本研究结果表明，低、中、高剂量苍耳亭干预后的UC大鼠结肠黏膜组织中炎症因子IL-6、TNF-α含量均明显降低，IL-10含量明显升高，Occludin、Claudin-1表达明显上调，结肠黏膜组织损伤减轻，提示苍耳亭能够减轻炎症反应，对UC大鼠结肠黏膜屏障功能和组织损伤具有保护作用。

ERK、JNK是丝氨酸蛋白酶家族的两种代表性蛋白酶，可参与肠道损伤，介导细胞分化，诱导多种细胞因子、蛋白的表达[23-24]。ERK、JNK在UC的发生中参与炎症反应与氧化应激反应，细胞中分泌的促炎因子能够激活JNK参与炎症反应[25]。ERK受到炎症因子刺激被激活，磷酸化的ERK参与调节细胞纤维化，诱导细胞凋亡[26]。使用药物干预后，ERK/JNK信号通路被抑制，能够有效缓解DSS诱导的UC小鼠炎症反应与细胞凋亡[27]。本研究结果显示，UC大鼠结肠黏膜组织中Caspase-3表达与p-ERK/ERK、p-JNK/JNK上调，提示结肠黏膜组织中细胞凋亡增加，ERK/JNK信号通路被激活。而苍耳亭干预后的UC大鼠结肠黏膜组织中Caspase-3表达与p-ERK/ERK、p-JNK/JNK下调，提示苍耳亭可能通过下调ERK、JNK磷酸化表达，抑制UC大鼠炎症反应与细胞凋亡，并上调Occludin、Claudin-1表达，改善结肠黏膜屏障功能，减轻UC大鼠结肠黏膜组织损伤。

综上所述，苍耳亭能够下调UC大鼠促炎因子IL-6、TNF-α和Caspase-3的表达，减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，上调抑炎因子IL-10和Occludin、Claudin-1表达，改善结肠黏膜屏障功能，减轻结肠黏膜组织损伤，其机制可能与抑制ERK/JNK信号通路表达有关，这为中医药治疗UC提供了新的理论依据。