添加乳酸片球菌AS185的益生菌Ricotta干酪品质评价

高岩松，王超，高磊，杨舸，赵玉娟，赵子健，牛春华，李盛钰

（吉林省农业科学院农产品加工研究所/国家乳品加工技术研发分中心，吉林长春 130033）

益生菌是一类对宿主健康有促进作用的活微生物，主要包括乳杆菌和双歧杆菌。益生菌通常用于乳制品中，包括酸奶、奶酪和冰淇淋等。干酪是益生菌的良好载体，益生菌添加到干酪中，除了可以提高益生菌的存活能力，还能增加干酪贮藏过程中的酸化，并有利于改善干酪的质地和丰富干酪的口感、风味等[1]。另外，一些功能性益生菌还能赋予干酪健康促进作用[2]。目前，益生菌已成功融入不同的干酪品种中，如切达干酪、高达、奶油干酪等。益生菌干酪（Probiotic Cheese）已成为功能食品重要的发展方向。

Ricotta 干酪是最受欢迎和最古老的乳清干酪品种[3]。它是一种质地柔软、口味温和的非成熟干酪。传统上，Ricotta 干酪是通过加热乳清并用乳酸酸化凝固乳清蛋白来制备的，其本质是蛋白质的共沉淀原理。Ricotta 被认为是一种健康食品，其脂肪含量低，蛋白质含量丰富，又含有多种矿物质和水溶性维生素。近年来，在Ricotta 干酪加工技术、品质改良和新产品开发等方面不断取得新的研究进展[4-6]。而在最近，一些益生菌，如嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（L.casei）、乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）和动物双岐杆菌（B.animalis）等应用于Ricotta 干酪中，开展了益生菌Ricotta 干酪流变学、质构、微观结构和风味等方面的研究，并开发了益生菌Ricotta 干酪产品[7-9]。作为益生菌的载体，乳清干酪与其他食品相比可能更具有优势，因为乳清干酪具有相对较高的水分含量、较高的pH 值、较低的盐含量和较低的含氧量，这些特性可能为益生菌提供更好的保护。但在乳清干酪基质中添加益生菌可能会对干酪的质构、感官和风味等产生不利影响。因此，开展符合益生菌乳清干酪加工要求的优良益生菌的筛选、评价和应用研究就变得尤为重要。然而，目前这方面的研究还有待深入。

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）AS185 由自然发酵农家黄豆酱中分离获得，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏编号：CCTCC NO:M 2018114）。本团队前期研究发现，AS185 菌株具有调节血脂、降低炎性粘附分子和炎性因子水平，能有效预防和减轻大鼠早期动脉粥样硬化，是一株有应用前景的功能益生菌新菌株[10]。本研究开发一款添加AS185 的益生菌Ricotta 干酪新产品，评价了AS185作为功能益生菌和附属发酵剂对干酪理化指标、质构特性、微观结构、风味发展和益生菌存活的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清，本实验室加工哈罗米干酪产生的副产物乳清水（蛋白质含量为0.85%、脂肪含量为0.53%、pH值为6.6）；无水柠檬酸（食品级），河南万邦实业有限公司。

改良M17 培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母膏2.5，磷酸甘油二钠10.0，硫酸镁0.25，异抗坏血酸钠0.5，琼脂粉20.0，pH 值7.1～7.2，115 ℃高压灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

MLS-3780 高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo 公司；BCN-1360B 无菌超净工作台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；HZQ-Q 电热恒温培养箱，上海一恒实验设备有限公司；Sorvall Evolotion RC 高速冷冻离心机，美国Thermo 公司；HYCV-407 干酪槽，黑龙江赫益乳业科技有限公司；Testo205 pH 计，德国Testo 公司；TA.XT plus 物性分析仪，英国 Stable Micro Systems公司；GC-MS 6890N-5875B 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司。

1.3 菌株及培养方法

乳酸片球菌（P.acidilactici）AS185 冻存菌株在改良M17 液体培养基中连续活化传代3 次后，按3%（V/V）接种量接种于改良M17 液体培养基中，37 ℃静置培养16 h，离心（4 000 r/min，4 ℃，10 min），弃上清，菌体沉淀用灭菌生理盐水洗涤2 次，离心（5 000 r/min，4 ℃，10 min），用灭菌PBS 溶液（pH 值7.2）洗涤沉淀的菌体2 次，重悬于PBS 溶液中，调整菌液浓度为1.0×1010CFU/mL，4 ℃冰箱保存，备用。

1.4 干酪制作工艺及操作要点

乳清干酪制作参考Sameer 等[9]的方法进行，具体工艺流程略有调整（图1），加工工艺要点如下：

图1 益生菌乳清干酪制备流程图Fig.1 Flow chart for preparation of probiotic Ricotta cheese

（1）乳清加热：以哈罗米干酪加工的副产物乳清为原料，将其加热至70 ℃；

（2）原料乳处理及添加：将生牛乳进行巴氏杀菌处理（63 ℃，30 min），然后按乳清水:杀菌乳=9:1（V/V）的比例添加至乳清水中；

（3）加热处理：将混有巴氏杀菌乳的乳清加热至90 ℃，保持15 min 后冷却至75 ℃；

（4）凝乳：将10%的柠檬酸溶液缓慢加入到乳清中，边加边搅拌，调整乳清pH 值5.4，至絮状凝块出现，静置5 min；

（5）凝块收集：用尼龙滤布（80 目）排出乳清，收集凝块；

（6）益生菌添加：向乳清干酪凝块中添加乳酸片球菌AS185菌悬液，使凝块中活菌数达到8 log CFU/g，对照组乳清干酪不添加益生菌

（7）拌盐：按乳清干酪凝块重量的1.5%添加无碘食用盐，并搅拌均匀；

（8）压制成型：将乳清凝块装入模具中，于7 ℃进行压制处理，0.2 MPa，20 h。

（9）包装与贮存：成型后的乳清干酪用单向透气膜进行真空包装，4 ℃贮存。

1.5 理化指标测定

取4 ℃贮存21 d 的对照干酪和益生菌干酪样品用于一般理化指标检测。脂肪含量测定采用GB 5009.6-2016；蛋白质含量测定采用GB 5009.5-2016；水分含量测定采用GB 5009.3-2016；pH 值采用Testo205 pH 计插入干酪样品直接测定。

1.6 贮存期益生菌稳定性测定

分别在于第0 天、第7 天、第14 天和第21 天取益生菌乳清干酪样品10 g，加入2%无菌柠檬酸钠溶液90 mL，充分均浆，用灭菌生理盐水倍比稀释，涂布于改良M17 固体培养基上，37 ℃静置培养48 h，进行菌落计数，结果以log CFU/g 计。

1.7 贮存期质构测定

分别于第0 天、第7 天、第14 天和第21 天取乳清干酪样品，切成边长为1.5 cm 的立方块，室温放置20 min 后，利用TA.XT plus 物性分析仪进行TPA 参数测定。测量模式：探头选择P 0.5，测量前探头下降速度为1.0 mm/s；测试速度为1.0 mm/s，测量后探头回程速度为10.0 mm/s，目标模式设置为压力，压力选择10%，下压变形时间为10.0 s，触发力为2 g。

1.8 挥发性成分的测定

采用HS-SPME-GC-MS（6890N-5975B 气相色谱-质谱联用仪）对贮存21 d 的乳清干酪样品进行测定。前处理方法：称取适量样品置于顶空瓶中，密封，在80 ℃水浴中平衡30 min，进行萃取处理，结束后，用萃取针在进样口解吸5 min。色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；载气流量1.0 mL/min；分流比：不分流；扫描方式：Full Scan。升温程序：起始柱温50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升至180 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min 的速率升至250 ℃，保持5 min。采集到的质谱图利用NIST 谱库进行检索，鉴定样品中的挥发性成分，并利用面积归一化法分析各成分的相对含量。

1.9 感官评定

在乳清干酪成熟21 d 时进行感官评定。邀请20名从事食品研究的人员组成评定小组，对干酪的外观色泽、滋、气味和组织状态进行感官评定。评定细则参照白建等[11]的方法进行，详细见表1。

表1 感官评分标准Table 1 The standard of sensory evaluation

1.10 数据分析

每组实验均进行5 次重复，结果以平均值±标准差（SD）表示。采用SPSS 19.0 统计软件对数据进行差异显著性分析，采用GraphPad Prism 7.0 软件作图；采用CANOCO 4.5 软件对理化指标、质构参数、感官指标和主要挥发性成分采用CANOCO 4.5软件进行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 结果与讨论

2.1 益生菌乳清干酪理化指标分析

由表2 可以看出，经21 d 的贮存后，益生菌乳清干酪中的脂肪、蛋白质和水分质量分数分别为17.60%、27.47%和49.95%，pH 值为4.75，与对照组乳清干酪在脂肪、蛋白质、水分含量及pH 值方面均无显著差异（p＞0.05），说明添加乳酸片球菌AS185 并不会对乳清干酪的理化指标产生影响。这也与之前Meira 等[7]和Kisan 等[8]报道的结果一致，益生菌的添加并不会影响乳清干酪的脂肪和蛋白质的总体含量变化。

表2 乳清干酪理化指标Table 2 Physicochemical characteristics of whey cheese

2.2 益生菌乳清干酪贮存期间微生物活菌数的变化

连续3 周定期对益生菌乳清干酪中的活菌数进行了监测，结果如图2 所示。随贮存期的延长，益生菌乳清干酪中活菌数呈下降趋势，第21 d 时，活菌数由最初的8.17 lg CFU/g 降至为7.45 lg CFU/g，仅降低不到1 个数量级，说明AS185 菌株在干酪中能保持较高的存活率。而生产益生菌干酪的一个前提是在较长的干酪成熟期和储存中能够充分存活，这是选择干酪用益生菌菌株时考虑的一个重要因素。普遍接受的益生菌食品的益生菌活菌数不低于6.0 lg CFU/g。许多研究已经在不同类型的干酪中加入了益生菌，如切达干酪、Cottage 干酪和新鲜干酪等，大多数干酪都较好地保持了益生菌的存活能力，甚至有的益生菌干酪还增加了益生菌活菌数[12]。这些结果证实了干酪是一种很好的益生菌载体。

图2 益生菌乳清干酪贮存期间乳酸菌活菌数的变化Fig.2 Changes in viable counts of probiotic whey cheese during storage

2.3 益生菌乳清干酪质构特性的分析

连续3 周定期对乳清干酪的质构特性变化进行了监测，结果如图3 所示。在第0 天时，益生菌乳清干酪的硬度、粘聚性、胶着度、咀嚼度和回复性均高于对照乳清干酪，弹性低于对照乳清干酪。随贮存期的延长，益生菌乳清干酪和对照组干酪的硬度、咀嚼度和胶着度在逐渐增加，弹性、粘聚性和回复性在逐渐降低。随干酪贮存时间延长，两组干酪的硬度均增加明显，Souza 等[13]报道含有嗜酸乳杆菌的Minas frescal干酪在贮藏过程中变硬。这可能与贮存期间乳清干酪水分含量降低有关[14]。贮存21 d，益生菌乳清干酪的硬度为723.85 g，略高于对照组干酪，但组间差异不显著。有研究指出[15]，优于添加益生菌，巴西半硬质羊奶干酪（Coalho）在存储过程中酸化增加，导致益生菌干酪的硬度高于对照干酪。而本研究虽然在Ricotta 干酪中添加了益生菌AS185，但由于贮存期较短，益生菌干酪与对照组干酪相比pH 值变化不明显（表2），导致两组干酪的硬度差异不显著。

图3 乳清干酪贮存期的质构参数变化Fig.3 Changes in texture parameters of whey cheese during storage

2.4 益生菌乳清干酪挥发性成分分析

由表3可以看出，对照乳清干酪检测出11类成分，益生菌乳清干酪检测出15 类成分。对照乳清干酪检测出的挥发性成分中主要类别有烯烃类和酸类，相对含量分别为31.03%，22.20%；益生菌乳清干酪检测出的挥发性成分中占主要类别有酸类、醇类、酮类，相对含量分别为38.56%、24.64%、13.76%。两者类别中烯烃类、醇类、酮类、酸类相对含量差别较大。烃类化合物主要来源于原料乳清，他们的阈值相对较高，对干酪整体风味的贡献较小[16]。醇类化合物能与脂肪酸进一步形成酯，所以能间接对风味产生作用。本研究中，对照乳清干酪中检测出2 种醇类化合物，相对含量7.48%；益生菌乳清干酪中检测出8 种醇类化合物，相对含量24.64%。醇类化合物种类和相对含量明显高于对照组，其产生的原因主要包括：一是与添加益生菌有关；二是干酪生化反应途径中的脂肪酶对干酪中的脂肪酸进行降解生成醇类化合物；三是乙醇主要由乳糖代谢中磷酸戊糖途径生成[17]。另外，醇类化合物还能够以氨基酸、乳糖、甲基酮还原等代谢途径进行合成。其中2,3-丁二醇可以赋予干酪水果味。郝晓娜等[18]报道了添加植物乳杆菌的干酪醇类化合物种类多于对照组，且赋予干酪水果香味和酒香味。酮类化合物对于干酪的风味具有重要的影响，益生菌乳清干酪的酮类化合物相对含量明显高于对照组干酪，苗君莅等[19]研究结果也证实了，添加植物乳酸杆菌的干酪，酮类化合物3-羟基-2-丁酮和2-丁酮的浓度明显高于对照组。短链脂肪酸较低的阈值保证了干酪的典型发酵风味，且每一种短链脂肪酸都有自己独特的味道。益生菌乳清干酪短链脂肪酸类化合物相对含量显著高于对照组。主要是由益生菌AS185 代谢产生的，且主要相对含量增加的的化合物为乙酸、辛酸、正癸酸。其中乙酸可以赋予干酪醋味，而辛酸赋予清香味和淡淡的水果酸气味。

表3 乳清干酪挥发性成分相对含量比较Table 3 Comparison of relative contents of volatile components in whey cheeses

2.5 感官评定

乳清干酪贮存21 d 后的感官评定结果如表4 所示。益生菌乳清干酪在外观色泽、滋气味和组织状态和总分方面的分值均略高于对照乳清干酪，但与对照组比较差异不显著（p＞0.05）。添加益生菌的干酪至少应该保持和显示原有干酪的风味属性。益生菌对干酪风味特性的影响主要取决于益生菌的种类和添加的菌株。此外，它还取决于菌株在干酪生产和储存过程中的代谢活动。许多研究表明，向干酪中添加益生菌并不会显著改变最终产品的风味和/或其他感官特性。例如，Papadopoulou 等[20]报道添加植物乳杆菌（L.plantarum）T571 的希腊Feta 干酪其感官特性与对照干酪相当，表明添加乳酸菌对感官标准没有不良影响。此外，Stanton 等[21]研究也发现，在切达干酪中添加了副干酪（L.paracasei）也得到了同样的结果。本研究的感官评定结果来看，所添加的益生菌乳酸片球菌AS185 不影响乳清干酪的整体感官特性。也有一些研究报道，在干酪中添加益生菌会降低产品的感官（尤其是风味）可接受性，Ong 等[22]的研究表明，添加干酪乳杆菌和ABC 培养基（嗜酸乳杆菌4962、B.longum1941 和干酪乳杆菌279）的干酪接受分数最低。Gomes 等[23]也发现添加嗜酸乳杆菌的Minas 新鲜干酪在外观、香味和质地方面得分较低，这与其pH值较低以及微生物的代谢产生大量的有机酸有关。

表4 乳清干酪感官评定Table 4 Sensory evaluation of whey cheese

2.6 乳清干酪理化指标、质构参数、感官评定与主要挥发性成分RDA 分析

通过RDA 分析考察了对照组和益生菌组乳清干酪的理化指标、质构、感官及挥发性成分的相关性。结果表明（图4），对照组乳清干酪与益生菌乳清干酪呈现分散趋势，提示了乳酸片球菌AS185 的添加可以使得乳清干酪的理化性质产生明显变化。在理化性质分析中，益生菌的添加与干酪的咀嚼度、胶着度和硬度呈正相关，而与水分、pH 值、滋气味、弹性、粘聚性和感官评定总分不呈现相关性。在挥发性成分分析中，乳酸片球菌AS185 的添加与酯类、酸类、醛类、酮类、醇类和醚类等挥发性成分的含量具有相关性，其中以酯类最为显著，而与胺类、烷烃类和烯烃类呈现的相关性较小。上述结果也进一步证实了乳酸片球菌AS185 可以显著改善干酪的质构，并促进酯类挥发性成分的增加，同时揭示了乳酸片球菌AS185 的添加促进了干酪的口感和风味的提升。

图4 乳清干酪理化指标、质构参数、感官评定与主要挥发性成分RDA 分析Fig.4 Physicochemical indexes,texture parameters,sensory evaluation and RDA analysis of main volatile components of whey cheese

3 结论

综上所述，本研究将一株益生性乳酸片球菌AS185 应用于Ricotta 干酪加工，开发了一款含功能性益生菌的乳清干酪。添加乳酸片球菌AS185 不影响Ricotta 乳清干酪的理化指标和质构特性；AS185 菌株在干酪贮存期内保持较高的活菌数；AS185 菌株有助于促进乳清干酪风味的形成，其中酸类、醇类、酮类的相对含量均高于对照组；益生菌添加对干酪外观色泽、滋气味和组织状态方面无显著影响，但整体可接受性方面优于对照干酪。益生菌乳酸片球菌AS185 的添加对Ricotta 干酪品质提升有积极作用。因此，乳酸片球菌AS185 是一株在益生菌乳清干酪生产中有应用前景的菌株。