英红九号红茶水提物通过调控TNF-α/NF-κB 信号通路缓解小鼠的急性酒精中毒

赖幸菲，王琼，黎秋华，孙伶俐，陈若虹，文帅，张镇标，刘晓慧*，孙世利*

（1.广东省农业科学院茶叶研究所，广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东广州 510640）（2.云南农业大学茶学院，云南昆明 650201）

急性酒精中毒（Acute Alcoholic Intoxication，AAI），即醉酒，是指短时间内摄入大量酒精，体内酒精的吸收大于代谢，被吸收的酒精进入到血液循环，通过血脑屏障入脑而抑制中枢神经系统的兴奋性，造成肝脏、心脏、肾脏等器官及消化、神经、免疫等系统的损伤的病理过程[1]。急性酒精中毒造成机体损伤的作用机制很复杂，多种途径参与损伤的发生，主要的机制有大量的乙醇及其代谢产物乙醛对肝脏的损伤机制、氧化应激、炎症机制等[2,3]。随着经济发展和人际交往的增加，酒精的消费量日益增加，WHO 发布的2018 年全球酒精与健康状况报告中指出，2016 年约300 万人死于饮酒，占全球总死亡人数的5.3%，而中国是全球饮酒致死人数最多的国家，酗酒、酒精依赖已经是当今我国乃至全世界日益严重的公共健康[4]。因此，安全、有效、无副作用的天然解酒产品的研发一直是当今世界持续关注的热点问题。

茶在中国最早是因其药用价值而出现的，早在三国（魏）张揖《广雅》和唐代《采茶录》中就有记载茶能“醒酒”，宋代杨士瀛《仁斋直指方》称茶能“解酒食之毒”，明代李士材《本草图解》称茶能治“酒毒”[5]。现代研究也表明茶叶[6-9]及其活性成分茶多酚[10,11]、儿茶素[12,13]、黄酮类[14]、L-茶氨酸[15,16]、没食子酸[17]等具有解酒或缓解酒精性肝损伤的作用。目前，有关茶叶缓解急性酒精中毒的研究主要是绿茶类和黑茶类，红茶类的研究则集中在对慢性酒精中毒的保护作用，有关其缓解AAI 的作用及机制的研究报道较少。

英红九号是广东省英德红茶的典型代表，在广东省大面积推广种植，英红九号红茶内含物丰富，品质优异，经济效益极高。有研究报道[18]，英红九号红茶（英红）中的茶黄素和茶红素的含量均高于云南红茶（滇红）和祁门红茶（祁红），英红九号红茶还具有抗氧化[18]、抗前列腺癌[19]、抑制肥胖[20,21]等功效，而有关英红九号红茶缓解AAI 的作用及机制的研究尚未见有报道。

因此，本实验采用一次灌胃过量白酒建立小鼠AAI 模型，通过灌胃不同剂量的英红九号红茶水提物（Yinghong NO.9 Black Tea Water Extract，YBTE），观察给药后小鼠的翻正反射消失和出现的时间，以及测定血清和肝脏中生化指标及相关炎症蛋白的表达，探究英红九号红茶缓解AAI 作用及分子机制，以期为开发天然的红茶解酒护肝产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

英红九号（Camellia sinensisvar.assamicacv.Yinghong 9）红茶，由广东省农业科学院茶叶研究所基地提供。二锅头白酒（56°），北京坛井坊酒业有限公司；谷丙转氨酶（ALT/GPT）测试盒、谷草转氨酶（AST/GOT）测试盒，南京建成生物工程有限公司；乙醇脱氢酶（ADH）酶联免疫分析试剂盒，武汉基因美生物科技有限公司；BCA 蛋白定量测试盒，Thermo Fisher Scientific；TNF-α、NF-κB、NF-κBp65 抗体，Cell Signing Technology；IL-1β、β-actin 抗体，Abcam公司。

1.2 试验动物

小鼠规格：SPF 级雄性ICR 小鼠，7 周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。饲养条件：小鼠饲养于（25±2）℃恒温环境中，相对湿度为50%～60%，光照12 h，自由摄食饮水，在SPF 级动物房适应性饲养1 周后进行试验。

1.3 仪器设备

TriStar LB941 多功能酶标仪，德国Berthold Technologies 公司；HE 90 水平电泳槽、VE 186 转移电泳槽、Tanon-5200 化学发光凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；高速冷冻离心机，Eppendorf；1200高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；JH-12-06 型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；OHAUS 准微量电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；ZMQS5001 型Millipore 纯水仪，密理博公司。

1.4 实验方法

1.4.1 YBTE 的制备

按茶水比（m/V）1:30，沸蒸馏水浸提2 次，每次浸提20 min，浸提结束后过滤，合并两次滤液，旋转蒸馏浓缩，冷冻干燥成冻干粉后置于干燥器内备用。

1.4.2 英红九号红茶生化成分的测定

水分含量：按照国标“GB 5009.3-2016 食品中水分的测定”进行测定；水浸出物含量：按照国标“GB/T 8305-2013 茶水浸出物测定”进行测定；茶多酚含量：按照国标“GB/T 8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法”进行测定；游离氨基酸总量：按照国标“GB/T 8314-2013 茶游离氨基酸总量的测定”进行测定；可溶性总糖含量：采用蒽酮-硫酸比色法测定；黄酮类含量采用三氯化铝比色法进行测定；茶黄素、茶红素和茶褐素的含量采用系统比色法进行测定。

儿茶素单体、没食子酸、咖啡碱含量参照国标“GB/T 8313-2018茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法”进行测定，并进行了改进，具体色谱条件如下：色谱柱：phenomenex C18柱（150×4.6 mm，5 μm）；检测波长280 nm；检测温度28 ℃；流动相A：含φ=0.5%乙酸、φ=1%乙腈和φ=2%甲醇的水溶液，流动相B：含φ=0.5%乙酸、φ=10%乙腈和φ=20%甲醇的水溶液；洗脱步骤：在30 min 内，A 相由72.5%到20%，B 相由27.5%到80%，30 min 后在5 min 内，A 相由20%恢复到72.5%，B 相由80%恢复到27.5%，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。以外标法按峰面积进行定量。

1.4.3 小鼠急性酒精中毒模型建立

取小鼠40 只，随机分成4 组，每组10 只，实验前禁食12 h，自由饮水，根据小鼠体重按15 mL/kg灌胃量，分别以56°白酒原液、56°白酒稀释液①（白酒:蒸馏水，3:1，V/V）、56°白酒稀释液②（白酒:蒸馏水，2:1，V/V）和56°白酒稀释液③（白酒:蒸馏水，1:1，V/V）灌胃小鼠，观察各组小鼠的活动状态，记录小鼠情况。以翻正反射是否消失作为小鼠醉酒与否的标准，即小鼠灌胃白酒一段时间后，使其背部朝下，若小鼠保持此姿势30 s，则认为翻正反射消失，即为醉酒。选择小鼠醉酒率最高而死亡率最低的白酒浓度，即为建立小鼠急性酒精中毒模型最适酒精浓度。

1.4.4 小鼠醉酒时间和醒酒时间的统计

取小鼠40 只，随机分成4 组，每组10 只，根据小鼠体重按量给药，分别设为是模型组、YBTE 低剂量组（500 mg/kg）、YBTE 中剂量组（1 000 mg/kg）和YBTE 高剂量组（2 000 mg/kg）。实验前禁食12 h，自由饮水，0 h 时各给药组均一次性灌胃给药，模型组灌胃等体积蒸馏水，30 min 后各组小鼠均分别按最适酒精剂量灌胃白酒，通过观察各组小鼠活动情况，记录小鼠翻正反射消失的时间和翻正反射出现的时间。

1.4.5 YBTE 缓解小鼠急性酒精中毒的作用机制研究

1.4.5.1 小鼠分组与给药

取小鼠50 只，随机分成5 组，每组10 只，根据小鼠体重按量给药，分别设为是正常组、模型组、YBTE 低剂量组（500 mg/kg）、YBTE 中剂量组（1 000 mg/kg）和YBTE 高剂量组（2 000 mg/kg）。实验前禁食12 h，自由饮水，按照1.4.4 进行灌胃给药，正常组灌胃等体积蒸馏水，30 min 后除正常组外，各组小鼠灌胃白酒，正常组灌胃等体积蒸馏水，末次灌胃结束1 h 后麻醉小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼处死后解剖取肝脏组织。

1.4.5.2 小鼠血清中ALT 和AST 活性的测定

收集血液静置30 min 后，于4 ℃温度下，3 000 r/min 离心20 min 分离得到血清，按照试剂盒说明书的方法检测血液中ALT 和AST 的活性。

1.4.5.3 小鼠血清和肝脏中ADH 活性的测定

采血完成后处死小鼠，迅速解剖取出肝脏，用预冷生理盐水漂洗并用滤纸吸干。剪取少量肝组织加入9 倍体积预冷的生理盐水进行匀浆，于4 ℃温度下，以2 500 r/min 离心15 min，得到上清液。按照试剂盒说明书的方法测定血清和肝脏组织中ADH 活力。

1.4.5.4 Western blotting 检测肝脏中炎症因子相关蛋白的表达

（1）肝组织中总蛋白的提取及样品制备

取各组肝组织约40 mg，按照1:10（m/V）比例，加入RIPA 裂解液，置于匀浆机上充分匀浆，匀浆结束后将匀浆管插入冰中静止1 h，收集匀浆液于1.5 mL离心管中，于4 ℃温度下，13 200 r/min 离心20 min等到上清液置于-80 ℃保存备用。

（2）定量蛋白

按照BCA 蛋白定量测试盒的说明书的方法对肝组织上清液进行蛋白定量。

（3）Western blot 免疫印迹实验

蛋白质样品电泳，转膜，5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭90 min，裁剪目标条带，选取目标蛋白的一抗于4 ℃孵育12 h，洗膜，孵育二抗，洗膜，ECL 法显影，用Image J 软件分析条带灰度。

1.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，结果以¯表示，采用方差分析（one-way ANOVA），p＜0.05 表示具有显著差异，p＜0.01 表示具有极显著差异。

小波分析是由法国石油工程师Morlet于1980年在进行地震数据分析工作时首创。它是一种信号的时间－频率分析方法，具有多分辨率分析的特点，在时域和频域都能反映出信号的振幅、相位和功率的局部变化特征，近年来广泛用于多尺度气候分析研究中［6］。Morlet小波母函数的形式为：

2 结果与分析

2.1 英红九号红茶生化成分分析

由表1 的结果可知，英红九号红茶茶多酚含量为19.36%，氨基酸含量为3.64%，咖啡碱含量为4.14%，黄酮类含量为0.72%，可溶性糖含量4.26%，没食子酸含量为0.23%，茶黄素含量为0.17%，茶红素含量为7.10%，茶褐素含量为2.48%。从表2 的结果可知，英红九号红茶儿茶素的总量为3.78%，各儿茶素单体的含量表现为EGC＞GCG＞EGCG＞CG＞GC≈ECG＞EC＞C。

表1 英红九号红茶生化成分含量（%wt）Table 1 Contents of the biochemical components in Yinghong NO.9 black tea (%wt)

表2 英红九号红茶儿茶素含量（%wt）Table 2 Contents of catechins monomers in Yinghong NO.9 black tea (%wt)

2.2 急性酒精中毒动物模型造模酒精浓度选择

由表3 的结果可知，56°白酒稀释液②处理组的小鼠均表现出翻正反射消失的现象，且没有小鼠出现死亡，因此选定该酒精浓度为急性酒精中毒动物模型最佳的造模浓度。

表3 不同酒精度白酒对小鼠翻正反射的影响Table 3 Contents of catechins monomers in Yinghong NO.9 black tea

2.3 YBTE对小鼠入睡时间和睡眠时间的影响

急性酒精中毒是指一次摄入过量酒精引起中枢神经系统由兴奋转为抑制的状态，临床上表现为反应迟钝嗜睡，严重者可出现昏迷、血压下降、呼吸困难甚至死亡[22]。小鼠过量摄入乙醇后会逐渐出现后腿拖地爬行，行动呆滞，昏睡、翻正反射消失等现象，以翻正反射是否消失作为小鼠醉酒与否的标准。有研究报道，绿茶和普洱茶均可延长急性酒精中毒小鼠的入睡时间，并能缩短其睡眠时间，具有良好的抗醉解酒作用[7]。本研究结果表明（图1a），模型组小鼠翻正反射消失的时间为24.89 min，YBTE高剂量组能极显著地延长小鼠的入睡时间，翻正反射消失的时间延长到40.89 min（p＜0.01），低剂量组和中剂量组则没有显著差异。从图1b 的结果可知，模型组小鼠翻正反射出现的时间为166.18 min，YBTE 高剂量组显著地缩短小鼠的睡眠时间，翻正反射出现的时间为95.75 min（p＜0.05），中剂量组的睡眠时间也有所缩短，但未达到显著差异。可见，英红九号红茶既能延长小鼠对乙醇的耐受时间，也能缩短睡眠时间。

图1 YBTE 对急性酒精中毒小鼠入睡时间和睡眠时间的影响Fig.1 Effects of YBTE on the time of losing righting reflex and sleeping time of mice with acute alcoholism

2.4 YBTE 对小鼠血清中ALT 和AST 活性的影响

AST 和ALT 是临床上判断肝损伤最重要的两项指标，当肝组织有损伤时，这两种酶就会释放到血清中，因此检测这两个指标在血清中的活性能判断肝脏的健康和功能情况。急性酒精中毒会引发肝损伤，血清中ALT和AST活性水平与肝脏损伤呈负相关性[23]。由图2 的结果可知，与正常组相比，模型组小鼠的摄入乙醇后，血清ALT（52.57 U/L）和AST（49.67 U/L）的活性均极显著提高（p＜0.01），说明乙醇导致了小鼠的肝脏功能受损。不同剂量YBTE 预处理后，小鼠血清中ALT 和AST 的活性均显著地降低（p＜0.01），且呈现剂量依赖效应，其中高剂量组小鼠的ALT 活性下降到22.89 U/L，AST 活性下降到29.58 U/L，这与Luczaj 等[24]的研究结果相似。以上结果表明英红九号红茶对乙醇引起的肝功能损伤具有一定保护作用。

图2 YBTE 对急性酒精中毒小鼠血清ALT 和AST 的影响Fig.2 Effects of YBTE on ALT and AST levels in the serum from mice with acute alcoholism

2.5 YBTE 对小鼠血清和肝脏中ADH 活性的影响

图3 YBTE 对急性酒精中毒小鼠血清和肝脏ADH 的影响Fig.3 Effects of YBTE on ADH activity in the serum and liver from mice with acute alcoholism

2.6 YBTE对小鼠肝脏中炎症因子相关蛋白表达影响

核因子-κΒ（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）NF-κB 是机体炎症反应和免疫应答的重要调节因子，同时也参与许多重要的生物过程的调控，多种疾病的发病机制与NF-κB 的异常活化有关[27]。大量研究表明，乙醇可激活肝组织中的NF-κB信号通路，使NF-κB磷酸化入核，激活多种促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β等）和NO 合酶的表达，引发肝细胞炎症、坏死，甚至凋亡[28-33]。因此，TNF-α/NF-κB 信号通路可能会成为缓解急性酒精中毒的重要靶点。有研究报道，绿茶和青蒿组合提取物可通过调控NF-κB 信号通路缓解酒精性胃炎[34]。另有文献报道，信阳红、白毫银针、君山银针、大红袍、茯砖茶、信阳毛尖六种茶叶水提物均能显著上调PPAR-αmRNA 相对表达水平，并能明显降低TNF-αmRNA 及IL-1βmRNA 的相对表达量，表明不同茶叶水提物具有良好的保肝效果[35]。此外，有研究表明茶叶中的活性成分儿茶素及EGCG 可通过抑制NF-κB 信号通路缓解酒精性脂肪肝或乙醇诱导的肝功能障碍、氧化应激和炎症[36,37]，L-茶氨酸可通过调控TNF-α/NF-κB 信号通路缓解酒精性肝损伤[38]。

本研究结果显示（图4），与正常组相比，模型组小鼠肝组织中p-NF-κB p65 的表达量极显著增加（p＜0.01），表明乙醇可以激活NF-κB 信号通路。与模型组比较，YBTE 低、中、高剂量组小鼠的肝组织的p-NF-κB p65 的表达量明显下降，中剂量组和高剂量组的表达水平达到显著差异（p＜0.05）。图5a、5b和5c 显示了TNF-α和IL-1β在小鼠肝脏中的表达情况。与正常组相比，模型组小鼠肝组织中TNF-α和IL-1β的表达量极显著增加（p＜0.01）。与模型组比较，YBTE 低、中、高剂量组小鼠的肝组织的TNF-α的表达量明显下降，其中，低剂量组和中剂量组达到显著差异（p＜0.05），高剂量组达到极显著差异（p＜0.01）；不同剂量YBTE 组中，IL-1β的表达水平均极显著降低（p＜0.01），说明英红九号红茶可以剂量依赖地降低p-NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表达，从而抑制炎症反应。

图4 YBTE 对急性酒精中毒小鼠肝脏中p-NF-κB p65 的表达水平影响Fig.4 Effects of YBTE on p-NF-κB p65 level in liver from mice with acute alcoholism

图5 YBTE 对急性酒精中毒小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β 的表达水平影响Fig.5 Effects of YBTE on TNF-α and IL-1β level in liver from mice with acute alcoholism

3 结论

综上所述，YBTE 能降低急性酒精中毒小鼠血清ALT 和AST 水平，增强血清和肝脏中ADH 的活性，加快乙醇在体内的代谢，并通过调控NF-κB 信号通路，下调肝脏中TNF-α、IL-1β等炎症因子表达，抑制炎症反应，从而起到具有良好的抗醉、解酒和护肝作用。本研究为红茶开发天然的解酒护肝产品提供理论基础，但英红九号红茶中富含多种活性功能成分，但其发挥缓解急性酒精中毒的作用的活性成分有待进一步的研究。