辣木异硫氰酸酯通过活化AMPK 抑制3T3-L1 脂肪细胞脂质积累

毛家英，白玉英，彭麟杰，解静,2,3*，田洋,2,3*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）（2.国家辣木加工技术研发专业中心，云南昆明 650201）（3.食药同源资源开发与利用教育部工程中研究中心，云南昆明 650201）

近年来，全球超重和肥胖的发病率增长明显，在发达国家和发展中国家均呈快速蔓延之势，带来了巨大的疾病隐患和健康威胁[1]，尤其是达到病态性肥胖时（BMI≥40 kg/m2），死亡率会急剧增加[2]。目前，抗肥胖药物种类繁多，虽然这些减肥药物具有显著的降低体重功效，但往往具有明显的副作用[3]。天然产物被认为是一种药理活性高的安全有效的天然资源，被认为是药物先导物的主要来源，因其结构简单且便于大规模生产而广受关注，因此，开发具有降脂活性、纯度较高的天然化合物药物具有一定的现实意义。

辣木（Moringa oleifera.Lam）是一种极具降脂潜力的天然产物，它含有的多种天然活性成分（如挥发油等）以及辣木提取物已被证实具有降低胆固醇吸收[4,5]、降低血糖[6]以及增加高脂饮食小鼠能量消耗的功效且无副作用[7,8]。异硫氰酸酯是一类具有杀菌[9]、抗氧化[10]、抗癌[11]及降血糖和降血脂[12]等生物活性的化合物。最新研究表明，辣木叶和辣木籽中富含辣木异硫氰酸酯 -4-[(α-L-rhamnosyloxy) benzyl]Isothiocyanates（MIC-1）[13]，相比于其它十字花科蔬菜中的异硫氰酸酯化合物具有更高的化学稳定性[14]，并且有证据显示MIC-1可能是辣木提取物调控糖脂代谢的主要活性物质[15,16]。因此，本研究以MIC-1 为实验材料，研究MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞脂质积累的抑制作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3T3-L1 前脂肪细胞购自中国科学院昆明动物研究。辣木籽购买于云南天佑科技开发有限公司。DMEM 培养基，Hyclone 公司；青霉素-链霉素、1 mol/L Tris-HCl（pH 值6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 值8.8）、BCA 蛋白测定试剂盒，碧云天公司；细胞裂解液、胰蛋白酶消化液、二甲基亚砜（DMSO）、油红O，solarbio公司；甘油含量测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒与游离脂肪酸测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；胎牛血清（FBS），BI 公司；qRT-PCR 试剂，TaKaRa公司。二抗，ABclonal 公司；一抗，万类生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

二氧化碳培养箱，苏州贝茵医疗器械有限公司；Z36HK 型高速台式冷冻离心机，德国 Hermle Labortechnik GmbH 公司；多功能酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；紫外可见分光光度计，北京德泉兴业商贸有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 MIC-1 的制备

辣木籽粉碎后用石油醚去油，以料液比（m:V）为1:60、温度30 ℃、pH 值为5、时间9 h 的提取条件获得酶解提取液，采用萃取、减压浓缩及重结晶获取纯净晶体备用，纯度达98%，MIC-1 的结构式如图1所示[17]。

图1 MIC-1 结构式Fig.1 The structure of MIC-1

1.3.2 3T3-L1 细胞培养、传代与分化生长

细胞传代：3T3-L1 前脂肪细胞用含w=10% FBS的高糖DMEM 培养基于在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，当覆盖率达80%左右经胰酶消化后接种于5 mm 培养皿中分化。

细胞分化：接种于5 mm 培养皿的3T3-L1 前脂肪细胞贴壁生长5～6 d 后，依次用MDI 和INS 诱导培养基培养3 d，再用10% FBS 高糖DMEM 培养基培养至细胞出现明显脂滴可用于后续实验[18]。

1.3.3 3T3-L1 细胞存活率检测

将3T3-L1 前脂肪细胞以每孔1×104个接种于96孔板中，用不同浓度的MIC-1（0、1、2、4、8、16 μmol/L）的10% FBS 培养基处理细胞48 h，倒掉上清，取含0.5 mg/mL MTT 的培养基以每孔100 μL 的量加入培养 4 h，每孔加入100 μL 二甲基亚砜（DMSO）。在492 nm 处测定吸光值，计算细胞存活率。

1.3.4 油红O 染色

油红O 和双蒸水以3:2 比例配制油红O 染液，混合后静置10 min，用0.45 μm 有机滤头过滤备用。将对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞以每皿2×105个的密度接种于5 mm 培养皿，按照分化步骤分化成功后，换以含不同浓度MIC-1（0、2、4 μmol/L）的10% FBS培养基处理48 h。用油红O 染色后，倒置显微镜观察脂滴形成情况。

1.3.5 3T3-L1 脂肪细胞Gly、TG 和FFA 含量的测定

将对数生长期的3T3-L1 前脂肪细胞以每皿2×105个的密度接种于5 mm 培养皿，按照分化步骤分化成功后，按1.3.4 中给药方式处理细胞，给药48 h 后，收集各组细胞，低速离心除杂后收集培养上清液。上清液中的Gly 和FFA 浓度按照试剂盒说明书测定。细胞匀浆液由PBS 洗涤2 次后匀浆获得，按BCA 法测定蛋白含量，进一步进行TG 含量的测定。

1.3.6 qRT-PC 法测定细胞中脂代谢相关因子mRNA 的表达水平

将对数生长期的3T3-L1 前脂肪细胞以每皿2×105个的密度接种于5 mm 培养皿，按照分化步骤分化成功后，按1.3.4 中给药方式处理细胞，给药48 h 后，收集各组细胞。按照试剂盒说明进行3T3-L1 细胞RNA的提取、逆转录得到cDNA，qPCR 测定获得样品CP值。采用相对定量法（ΔΔCT）进行数据分析。

1.3.7 Western Blot 法检测3T3-L1 脂肪细胞中AMPK 蛋白和PPARγ蛋白表达水平

将对数生长期的3T3-L1 前脂肪细胞以每皿2×105个的密度接种于5 mm 培养皿，按照分化步骤分化成功后，按1.3.4 中给药方式处理细胞48 h。裂解30 min后离心获取蛋白上清液，并BCA 法测定其浓度。制得蛋白样品后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，通过Image J 软件分析蛋白质条带，定量检测蛋白质表达水平。

1.4 数据统计

实验数据使用Graphpad prism 等软件进行分析统计，组间比较采用单因素方差分析（所有实验均重复3 次），*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***p＜0.001。

2 结果与分析

2.1 MIC-1 对3T3-L1 前脂肪细胞存活率的影响

如图2 所示，用不同浓度的MIC-1（0、1、2、4、8、16 μmol/L）处理3T3-L1 前脂肪细胞48 h 后，与对照组（0 μmol/L）相比，MIC-1 对3T3-L1 前脂肪细胞存活率无明显影响，差异无统计学意义。结果表明MIC-1 对3T3-L1 前脂肪细胞无毒性。

图2 MIC-1 对3T3-L1 前脂肪细胞存活率的影响Fig.2 Effect of MIC-1 on the survival rate of 3T3-L1 adipocytes

2.2 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞脂质积累的影响

前脂肪细胞的过度分化和脂肪细胞体积的增大是肥胖的主要表现[19]。通过油红O 染液染色观察细胞形态变化是确定细胞胞质内脂肪沉积的常用方法。如图3 所示，对照组（0 μmol/L）脂肪细胞分布密集，脂滴较大，胞质内脂滴聚集明显，表明细胞出现了明显的成脂分化现象；用2、4 μmol/L 的MIC-1 处理48 h 后，细胞脂滴聚集明显减少，分布较稀疏，有许多未着色细胞群，而且MIC-1 的处理浓度越高，脂滴数量以及大小也随之减小。结果表明，MIC-1 具有抑制脂质积累的作用。与Huang 等[20]的研究结果一致。

图3 不同浓度MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞脂质积累的影响Fig.3 Effect of different concentrations of MIC-1 on lipid accumulation of 3T3-L1 adipocytes

2.3 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞内TG、FFA 和Gly 水平的影响

分化成熟的脂肪细胞合成的TG 以脂滴的形式在胞质内过度堆积，当机体能量消耗比摄取量多时，储存的甘油三酯就会分解为Gly 和FFA[21]。研究表明FFA 的异常可能是引起异位脂质积聚和脂毒性的关键因素之一[22]。通过对细胞内TG 浓度及其水解物含量的测定可以进一步确定MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞脂代谢的影响。如图4 所示，经MIC-1 处理后，与对照组（0 μmol/L）相比，MIC-1 处理降低了脂肪细胞内TG 浓度及其上清液中的FFA 浓度，2 μmol/L 和4 μmol/L MIC-1 组中TG 浓度较对照组分别下降53.00%（p＜0.001）和64.00%（p＜0.001），FFA 浓度分别下降59.00%（p＜0.001）和75.00%（p＜0.001）。同时，MIC-1 处理还能提升细胞培养上清液中的Gly浓度，当MIC-1 的浓度达到4 μmol/L 时，Gly 浓度较对照组相比可显著增加87.93%（p＜0.05）。上述结果表明MIC-1 显著促进3T3-L1 脂肪细胞中TG 水解，同时抑制FFA 的溢出[23]，改善脂肪细胞的脂代谢。

图4 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞内TG(a)、FFA(b)和Gly(c)浓度的影响Fig.4 Effect of MIC-1 on the levels of TG (a),FFA (b) and Gly(c) in 3T3-L1 adipocytes

2.4 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞脂代谢相关因子mRNA 表达水平的影响

脂肪的生成需要多种核转录因子的参与。在脂代谢的过程中，PPARγ是脂肪生成和分化的关键调节因子，SCD1是参与合成的关键酶，二者与脂肪的生成、贮存等过程密切相关。如图5 所示，经不同浓度的MIC-1 处理后的3T3-L1 脂肪细胞中PPARγ和硬脂酰辅酶A 去饱和酶1（SCD1）mRNA 表达水平显著降低。与对照组相比，当MIC-1 剂量为4 μmol/L 时，3T3-L1 脂肪细胞的PPARγ和SCD1mRNA 表达水平分别显著降低了46.00%（p＜0.05）和62.00%（p＜0.05）。据报道白藜芦醇可通过抑制SCD1mRNA表达水平抑制HepG2 细胞的脂肪合成[24]，与本研究结果相一致。上述结果表明，MIC-1 通过抑制3T3-L1脂肪细胞中脂肪合成相关因子PPARγ和SCD1的转录，抑制脂肪的生成，进而抑制脂质积累。

图5 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞中PPARγ(A)和SCD1(B) mRNA表达水平的影响Fig.5 Effect of MIC-1 on PPARγ (A) and SCD1 (B) mRNA levels in 3T3-L1adipocytes

2.5 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞AMPK 通路相关蛋白表达水平的影响

图6 MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞中p-AMPK 和PPARγ 蛋白表达水平的影响Fig.6 Effect of MIC-1 on p-AMPK and PPARγ protein expression levels in 3T3-L1adipocytes

AMPK 是PPARγ的上游因子，AMPK 通过改变参与脂肪代谢的蛋白质和酶的表达模式直接调节脂肪酸合成和氧化，并且调节前脂肪细胞分化。在之前的研究中我们发现辣木叶石油醚提取物可激活AMPK信号通路从而抑制脂肪生成[25]。在本研究中，经不同浓度的MIC-1 处理后，3T3-L1 脂肪细胞中AMPK 蛋白磷酸化水平呈递增趋势，当MIC-1 的浓度达到4 μmol/L 时，AMPK 蛋白磷酸化水平与对照组相比显著增加64.47%（p＜0.01）。同时PPARγ蛋白表达水平呈下降趋势，与对照组相比，2 μmol/L 和4 μmol/L MIC-1 处理后，PPARγ蛋白表达水平分别下降了27.39%（p＜0.05）和52.10%（p＜0.01）。结果表明MIC-1 可能通过活化AMPK 从而抑制PPARγ的表达来调控脂肪的合成及储存。

3 结论

目前，在我国的面临的公共卫生问题中，肥胖位居前列。如何医治肥胖症是人们共同面临的问题与挑战。在本研究中，天然化合物MIC-1 对3T3-L1 脂肪细胞的脂质积累具有显著的抑制作用，并且其机制可能是活化AMPK，下调PPARγ和SCD1mRNA 表达水平有关，进而促进TG 分解和抑制TG 的合成。研究结果为深入探讨MIC-1抑制脂肪积累的作用及机制奠定基础，也为辣木资源的深加工提供科学依据。