人胶质瘤中HIF1A和MAGED4的表达及调控关系初探

王 平， 闭水清， 刘 畅， 农蔚霞， 邹小琼， 薛春红， 王燕靖， 李 枫， 张庆梅， 谢小薰

胶质瘤是人类原发性恶性脑肿瘤中最常见的类型，根据其恶性程度的不同，可以分为低级别胶质瘤(low-grade glioma,LGG)和高级别胶质瘤(high grade glioma,HGG)。尽管有包括手术联合放化疗等一系列综合治疗方案，但患者的总体预后仍较差，尤其是胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)患者[1]。肿瘤的高度增殖状态导致肿瘤组织处于缺氧的微环境状态，目前研究认为缺氧诱导因子1A(hypoxia-inducible factor 1A,HIF1A)是肿瘤细胞缺氧反应的重要调节因子[2]。黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一个多基因大家族，其许多成员在正常组织(除睾丸外)中限制性表达，而在多种肿瘤组织中呈高表达，被视为肿瘤生物治疗的理想靶点[3]。其中，MAGED4作为MAGE家族中的新成员，被认为是肿瘤相关抗原[4]。有研究显示，MAGED4在乳腺癌[5]、非小细胞肺癌[6]、口腔鳞癌[7]、肝细胞癌[8]和结直肠癌[9]等多种肿瘤中呈高表达，并认为其参与了肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭过程，与患者预后不良相关。HIF1A可以调控多种因子的表达，如促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、葡萄糖载体蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)等[10-11]。但HIF1A与MAGED4之间的关系尚不明确，本研究旨在分析胶质瘤中HIF1A、MAGED4的表达水平及其临床意义，并探讨二者之间的调控关系，为胶质瘤的靶向治疗提供参考思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1生物信息学资料 通过基因表达谱交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库[12]分析人胶质瘤中MAGED4和HIF1A的mRNA表达情况。基因搜索关键词为“HIF1A”“MAGED4”，选择数据来源为TCGA、GTEx项目的肿瘤和正常组织样本数据，肿瘤类型为LGG和GBM。共获取888例样本数据，其中GBM组织163例，LGG组织518例，正常脑组织207例。另外，从中国胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)数据库[13-14]中下载mRNA-seq_693数据集及相应的临床信息[15]。纳入标准：(1)临床病理诊断明确为世界卫生组织(World Health Organization，WHO)Ⅱ～Ⅳ级胶质瘤；(2)患者临床特征信息完善；(3)年龄不限，性别不限。排除标准：(1)临床信息数据不全者；(2)合并其他恶性疾病者。共纳入693例样本数据，合并临床数据与HIF1A mRNA、MAGED4 mRNA表达水平数据，并以中位数为界将其分为高表达组和低表达组，分析二者与临床特征之间的关联性。

1.2细胞培养和缺氧模型构建 选择人胶质瘤细胞系U251、U87-MG，购自中国科学院上海细胞生物学研究所并由本实验室保存。将U87-MG细胞和U251细胞置于恒温培养箱(37 ℃，5% CO2)中，并使用含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10%胎牛血清(加拿大Wisent公司)的DMEM高糖培养基(加拿大Wisent公司)进行培养。使用氯化钴(CAS 7791-13-1,Sigma)构建细胞体外缺氧模型，将氯化钴溶解于无菌无酶水中，配制成10 mmol/L浓度的母液，-20 ℃避光保存。用DMEM完全培养基配制成浓度分别为0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的缺氧培养基用于模拟缺氧环境。

1.3CCK-8实验 取对数生长期状态良好的胶质瘤细胞，经胰酶消化后，用完全培养基制备成5×103cells/ml的细胞悬液，接种于96孔板中(100 μl/孔)，24 h后分别更换为含不同氯化钴浓度的缺氧培养基，培养48 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，细胞培养箱中继续孵育2 h后使用Sunrise酶标仪(奥地利Tecan公司)测定450 nm处的OD值。

1.4细胞转染 将细胞种于6孔板中，按照LipofectamineTM3000(美国Invitrogen公司)转染试剂说明书将阴性对照siRNA和HIF1A siRNA分别转染入胶质瘤细胞，并于缺氧培养基中培养48 h后收集细胞进行相关实验。HIF1A siRNA和阴性对照siRNA由生工生物(上海)股份有限公司合成，序列见表1。

表1 siRNA序列

1.5总RNA提取和实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)实验 采用RNA提取试剂盒(南京诺唯赞公司，RC101-01)提取细胞总RNA。应用分光光度计(北京天根公司)检测RNA浓度和吸光度值。采用cDNA逆转录试剂盒(南京诺唯赞公司，R323-01)将RNA逆转录成cDNA。应用StepOnePlus qPCR仪行RT-qPCR，试剂盒购自南京诺唯赞公司(Q711-02)，反应体系：SYBR Green I Master 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40个循环反应。以β-actin为内参，根据2-△△Ct法计算相对表达量。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，序列见表2。

表2 RT-qPCR扩增引物序列

1.6蛋白免疫印记(Western blot，WB)实验 依照蛋白提取试剂盒(北京索莱宝公司)说明书步骤提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸5 min使蛋白变性，自然冷却后于-80 ℃保存备检。将准备好的蛋白依次通过电泳、转膜、封闭，以及一抗、二抗孵育步骤。应用Fluor Chem FC3成像仪进行显影，并使用Image J软件分析条带灰度值，以β-actin为内参计算相对灰度值。HIF1A抗体(36169，CST；1∶1 000稀释)，MAGED4抗体(sc-393203，Santa Cruz；1∶200稀释)，β-actin抗体(15G5A11/E2，ThermoFisher Scientific；1∶2 000稀释)，兔抗小鼠二抗(ab6728，Abcam；1∶5 000稀释)，山羊抗兔二抗(ab6721，Abcam；1∶5 000稀释)。

2 结果

2.1胶质瘤组织中HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA表达情况 基于GEPIA数据库的分析结果显示，LGG和GBM组织的HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA水平均高于正常脑组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。基于CGGA数据库的分析结果显示，MAGED4 mRNA表达水平与HIF1A mRNA表达水平呈正相关(r=0.322，P=0.000)。

注：经成组t检验，*P<0.05

2.2HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA表达水平与胶质瘤患者临床特征指标的关联性分析结果 MAGED4 mRNA高表达组年龄≤40岁、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突变型的人数比例大于MAGED4 mRNA低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组性别、肿瘤类型、WHO肿瘤分级，O6-甲基鸟瞟-DNA甲基转移酶(O6-methylguanie-DNA methyltransferase,MGMT)启动子甲基化状态、1p/19q共缺失情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。HIF1A mRNA表达水平与以上临床指标均无显著关联性(P>0.05)。见表3，4。

表3 MAGED4 mRNA表达水平与胶质瘤患者临床特征指标的关联性分析结果[n(%)]

表4 HIF1A mRNA表达水平与胶质瘤患者临床特征指标的关联性分析结果[n(%)]

2.3胶质瘤细胞体外缺氧模型构建结果 经含不同浓度氯化钴的缺氧培养基培养48 h后，CCK-8实验结果显示，与氯化钴浓度0 μmol/L相比，U87-MG细胞和U251细胞分别在氯化钴浓度为100 μmol/L和300 μmol/L时细胞活性最高，且随着氯化钴浓度继续上升，细胞活性下降。故选择100 μmol/L作为U87-MG细胞的最佳造模浓度，选择300 μmol/L作为U251细胞的最佳造模浓度。见图2。

图2 不同浓度氯化钴的缺氧培养基对U87-MG和U251细胞活性的影响图

2.4缺氧条件下沉默HIF1A对MAGED4表达的影响 将HIF1A siRNA转染至U87-MG和U251细胞，并在缺氧条件下培养48 h，RT-qPCR结果显示，HIF1A mRNA表达下调后，MAGED4 mRNA表达水平也显著下降(P<0.05)。见图3。WB结果也显示，HIF1A蛋白表达下调后，MAGED4蛋白表达水平也显著下降(P<0.05)。见图4。

图3 下调胶质瘤细胞HIF1A mRNA表达后MAGED4 mRNA表达变化图

图4 下调胶质瘤细胞HIF1A蛋白后MAGED4蛋白表达变化图

3 讨论

3.1研究表明，胶质瘤占恶性脑肿瘤的75%，其中一半以上是GBM，多数GBM患者生存期不到1年[16]。目前胶质瘤的治疗标准方案是最大限度地切除肿瘤和术后放化疗，但胶质瘤浸润性的特征使得手术有时不能完全切除所有肿瘤组织，残留的肿瘤可能引起术后复发。随着研究的进展，越来越多的研究证明胶质瘤基因型可提供更准确的诊断、预后策略。肿瘤分子靶向治疗作为发展中的新辅助治疗方法受到越来越多的关注，基于胶质瘤特异性分子的靶向治疗可能使患者在手术和辅助放化疗之外获得更佳的预后，而发掘有效的胶质瘤特异性分子是肿瘤靶向治疗的前提。

3.2已有研究鉴定出了MAGED4相关的HLA-A*25限制性抗原肽[17]。此外，相关研究发现MAGED4特异性的T淋巴细胞能杀伤MAGED4阳性的肿瘤细胞[18]。本课题组前期的研究也发现，MAGED4与胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关[19]，并与冠状蛋白样肌动蛋白结合蛋白1C(coronin 1C,CORO1C)、细胞分裂周期因子25A(cell division cycle 25A,CDC25A)等多种肿瘤相关分子之间存在调控关系[20]，其表达可受p53、特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)等转录因子调节[21]。这些结果都提示MAGED4属于胶质瘤特异性的分子，具有成为胶质瘤靶向免疫治疗的潜能，而探究胶质瘤中MAGED4的表达调控关系，寻找消除胶质瘤中MAGED4异质性表达方法尤为关键。

3.3HIF1最早于20世纪90年代由Semenza等[22]在缺氧处理的肝癌细胞株中发现。HIF1由HIF1A和HIF1B两个亚基组成，其中HIF1A是功能性亚基，决定HIF1的活性[23]，在常氧状态下，HIF1A可通过泛素-蛋白酶体降解途径降解；在缺氧条件下HIF1A稳定存在。HIF1B作为结构性亚基，不受氧的调节[24]。氯化钴中的Co2+能置换催化基团上的Fe2+，从而阻断泛素-蛋白酶体降解途径，抑制HIF1A的降解[25]。本研究中使用氯化钴模拟了细胞体外缺氧环境，并通过CCK-8实验筛选出最佳的氯化钴浓度，发现低浓度的氯化钴模拟缺氧可以促进肿瘤细胞的活性，而高浓度的氯化钴可能因药物毒性作用而抑制细胞的活性。肿瘤的发生、发展涉及到多种调控机制的相互作用，其中HIF1A是肿瘤缺氧信号通路的中枢调节因子[25-27]，可作为转录因子调节多种基因的转录，这些下游的靶基因参与了血管新生、糖酵解、红细胞生成，以及细胞增殖、迁移、侵袭等多种细胞功能。虽然目前已发现了大量的HIF1A下游靶基因，但在胶质瘤中HIF1A相关的诊断、预后标志物以及潜在的靶向治疗靶点仍有待进一步发掘。

3.4本研究通过GEPIA数据库发现HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA在胶质瘤中均呈高表达。分析CGGA数据库的临床数据资料发现，MAGED4 mRNA的表达与患者年龄、IDH突变相关，但与性别、肿瘤类型、WHO肿瘤分级、MGMT启动子甲基化状态等无显著关联。根据2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类[28]，该结果可能提示MAGED4的表达与胶质瘤的分型相关，但仍有待进一步研究。HIF1A与患者年龄、性别、样本类型、WHO肿瘤分级、IDH突变等均无显著关联，这可能因为HIF1A的表达主要与组织缺氧程度相关，但可能也与收集到的样本量有限有关，有待进一步探索。另外，基于公共数据的分析结果显示，MAGED4 mRNA与HIF1A mRNA的表达呈正相关，而这也在本研究的细胞实验中得到验证。由此推测，胶质瘤中MAGED4的表达与缺氧密切相关，可能是HIF1A的潜在下游靶基因，调控MAGED4的表达可能会影响胶质瘤患者的疾病进展，为胶质瘤的的分子靶向治疗提供了潜在的靶点。

本研究虽然发现胶质瘤细胞中HIF1A可以调控MAGED4的表达，但是本研究仅进行了体外的初步验证，今后还需从体内外进一步研究二者的相关性及对具体的调控机制进行探索。