三种前处理方法对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定曲霉结果的对比研究

袁凯旋， 欧阳峰， 刘泓伶， 胡雪姣， 赵云虎， 陈晓丽， 叶 龙， 顾 兵

近年来，随着免疫抑制人群的增加，侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)发病率有所上升。IA临床表现复杂、诊治困难，具有感染率高、漏诊率高、死亡率高的特点，且不同曲霉存在耐药性差异，因此实现曲霉的快速鉴定仍是难题与挑战[1]。目前，曲霉的实验室鉴定主要依赖于传统形态学，耗时较长，易出现鉴定错误或无法鉴定的情况[2]。此外，血清学检测中的G(1-3-β-D glucan)试验、GM(galactomannan)试验或曲霉抗原抗体试验虽能够提示曲霉感染的可能，但易受多种因素影响呈现假阳性和假阴性，且真菌血清学检测存在交叉反应，难以判断真菌种属[3]。分子诊断对场地、设备及技术人员的要求均较高，且检测成本高、操作繁琐，技术不成熟或未标准化，导致其临床应用受限。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF MS)在微生物检测领域发展迅速，能够识别多种医学上重要的真菌，包括念珠菌、隐球菌，以及部分丝状真菌等[4]。然而，丝状真菌细胞壁较厚，破壁困难，蛋白不易提取从而影响质谱蛋白图谱质量，导致鉴定效果不佳[5]。目前，MALDI-TOF MS技术在丝状真菌鉴定领域仍然处于探索阶段，曲霉为临床上引起IA的最常见丝状真菌，对于其蛋白质提取方法，尚无统一标准化的破壁操作规范。提高曲霉破壁效果和质谱鉴定效能，寻求高效的前处理方法为实验的关键。基于以上现状，为寻求最优曲霉前处理方法，本研究将以VITEK MS为平台，通过分析比较磁珠研磨法、冷冻研磨法和甲酸萃取法三种前处理方法对曲霉质谱鉴定结果的差异，探讨适合于曲霉质谱鉴定的最佳前处理方法，实现曲霉质谱快速鉴定，及时为临床提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2021年1月至2021年12月由广东省人民医院临床分离的非重复曲霉114株，其中烟曲霉20株，黑曲霉14株，黄曲霉20株，土曲霉20株，聚多曲霉20株，构巢曲霉20株，均经基因检测鉴定。标准菌株3株，包括黄曲霉ATCC3631、烟曲霉ATCC MYA 3626、土曲霉ATCC MYA 3633，购自中国真菌保藏中心。所纳入的曲霉菌株为临床常见引起IA的种类，并排除同一患者分离的重复菌株。

1.2试剂与仪器 VITEK MS质谱仪(法国生物梅里埃公司，型号VITEK MS)，冷冻研磨仪(广州露卡测序仪器有限公司，型号LUKYM-11)，磁珠(广州露卡测序仪器有限公司，规格Ø3和Ø5)，光学显微镜(日本Olympus公司，型号BX53)，霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号MJ-150F-1)，无菌预装提取管(湖北新纵科公司，型号NZK-M16018-02)，一次性靶板(法国生物梅里埃公司，型号1111281BM)，基质液(法国生物梅里埃公司，批号1009271920)，大肠埃希菌ATCC 8739(法国生物梅里埃公司)，乙腈(上海阿拉丁公司，批号K2123013)，70%甲酸(上海阿拉丁公司，批号I2110247)，沙保葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud dextrose agar，SDA；江门凯林公司，批号220701)。

1.3菌株培养及鉴定 将菌株转种于SDA，在28 ℃霉菌培养箱培养2 d。采用透明胶带法[6]在光学显微镜下观察菌丝、孢子以及产孢结构等形态特征，进行辨认。对于部分产孢不良的菌株采用小培养法[7]进行辅助鉴定。

1.4基因测序 根据Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取真菌DNA，应用真菌通用引物对内转录间隔区进行PCR扩增，引物序列为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反应总体积为50 μl：Taq PCR Master Mix 25 μl、DNA模板5 μl、0.2 μmol/L上、下游引物各2 μl、双蒸水(double distilled water,ddH2O)16 μl。扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。使用Contig Express 9.1软件将两端序列进行拼接和手动矫正后，在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MYCOBANK数据库(https://www.mycobank.org/)上进行比对，种、属信息鉴定原则参照相关标准[8]。

1.5MALDI-TOF MS前处理

1.5.1 磁珠研磨法 采用潮湿的拭子于菌落边缘收集1～2 cm直径的曲霉孢子和菌丝，将其悬于含900 μl 70%乙醇的2 ml的无菌预装提取管，于涡旋振荡器振荡研磨10 min。研磨后将菌悬液全部转移至新的2 ml EP管中，(10 000～14 000)×g离心2 min，弃上清，待乙醇完全挥发干后，加入40 μl新鲜配制的70%甲酸溶液，涡旋振荡混匀(3 s)。加入40 μl乙腈，涡旋振荡混匀(3 s)，(10 000～14 000)×g离心2 min，待测。

1.5.2 冷冻研磨法 取2 ml EP管，加入无菌磁珠3～4颗，用潮湿的拭子于菌落边缘收集1～2 cm直径的孢子和菌丝，将其悬于含900 μl 70%乙醇的EP管中灭活10 min。设置仪器研磨频率为80 Hz/s，预冷温度-35 ℃，设置每一研磨循环时间为60 s。将获得的菌丝匀浆全部转移至新的无菌EP管，(10 000～14 000)×g离心2 min，弃上清，待乙醇完全挥发后加入40 μl新鲜配制的70%甲酸，涡旋振荡混匀(3 s)，加入40 μl乙腈涡旋振荡混匀(3 s)，(10 000～14 000)×g离心2 min，待测。

1.5.3 甲酸萃取法 取2 ml EP管，加入40 μl新鲜配制的70%甲酸，使用200 μl TIP头于菌落边缘挑取少许孢子和菌丝，混匀其中，点振充分，待测。

1.6MALDI-TOF MS检测与结果判读 取1 μl上清液涂靶板，待干燥后覆以1 μl基质液，自然干燥后进行质谱检测，采用RUO SARAMIS数据库(版本4.14)进行判断。每株菌株重复检测2次，若第1次无鉴定结果，则按照上述流程再次进行检测；若第2次仍无结果，则认为鉴定失败。根据RUO SARAMIS数据库，结果判读标准为：深绿色提示鉴定分值≥1 000，置信度为99.9%；浅绿色提示鉴定分值900～999，置信度为90.0%～99.9%；黄色提示鉴定分值800～899，置信度为80.0%～89.9%；白色提示鉴定分值750～799或<750，置信度为75.0%～79.9%或无匹配结果；红色提示结果有冲突或低分辨率。记录不同前处理方法下的峰数目、置信度、鉴定结果和耗时。

2 结果

2.1三种前处理方法对曲霉质谱鉴定率的比较 117株曲霉分别采用磁珠研磨法、冷冻研磨法和甲酸萃取法进行前处理后获得的质谱鉴定率分别为90.60%(106/117)、61.54%(72/117)和57.26%(67/117)，磁珠研磨法的鉴定率与其他两组比较有显著差异(P<0.001)，提示磁珠研磨法鉴定率显著优于其他两种方法。三种前处理方法对不同种曲霉的鉴定率的比较方面，磁珠研磨法和甲酸萃取法可将21株烟曲霉全部准确鉴定(100.00%)，冷冻研磨法可将20株烟曲霉准确鉴定(95.24%)，可见三种方法对烟曲霉鉴定效果较好(P>0.05)。磁珠研磨法对黄曲霉、黑曲霉、聚多曲霉和构巢曲霉的鉴定率分别为90.48%(19/21)、64.29%(9/14)、85.00%(17/20)和100.00%(20/20)，显著优于其他两种方法(P<0.05)，该方法除黑曲霉表现出较低鉴定率(64.28%)之外，其余鉴定率均在85%以上。见表1。

表1 三种前处理方法对曲霉的鉴定率比较[n(%)]

2.2三种前处理方法对曲霉质谱鉴定的平均置信度、平均峰数量比较 117株曲霉分别采用磁珠研磨法、冷冻研磨法和甲酸萃取法进行前处理后获得的平均质谱置信度为90.56%、51.31%和46.51%，三者比较有显著性差异(P<0.001)。磁珠研磨法所获得的结果置信度显著高于其他两种方法，且在不同曲霉种水平上的置信度均高于其他两种方法(P<0.05)。三种前处理方法所获得的平均峰数目分别为208、186和168，三者比较有显著性差异(P<0.001)。磁珠研磨法较于其他两种方法可获得更高的峰数量，与质谱数据库中的图谱匹配程度更高，且在不同曲霉种水平上的峰数量均显著高于其他两种方法(P<0.05)。见表2。

表2 三种前处理方法对曲霉质谱鉴定的平均置信度、平均峰数量比较

2.3三种前处理方法对曲霉鉴定的耗时比较 以20株曲霉为一组，重复检测2次，分别对三种前处理方法的菌株采集及灭活、研磨或萃取、加入甲酸乙腈/离心、涂靶板、滴加基质液和质谱分析6个步骤进行计时，每完成一个步骤及时记录计时器上时间读数。采用冷冻研磨法完成一次质谱鉴定流程耗时(90.00±1.05)min，磁珠研磨法耗时(73.87±0.32)min，甲酸萃取法耗时(35.33±0.61)min，在耗时上三种方法比较有显著差异(F=4 474.992，P<0.001)。见表3。

表3 三种前处理方法对曲霉鉴定的耗时比较(min)

2.4三种前处理方法的质谱图谱分析结果 黄曲霉ATCC3631、烟曲霉ATCC MYA 3626、土曲霉ATCC MYA 3633经上述3种方法前处理后进行质谱检测获取蛋白图谱。对于黄曲霉，磁珠研磨法在质荷比约4 424.40 m/z、6 819.59 m/z、8 423.08 m/z、10 292.33 m/z、11 949.76 m/z和13 639.24 m/z处均出现特征峰；冷冻研磨法在4 426.10 m/z、6 293.28 m/z和7 300.07 m/z出现特征峰；甲酸萃取法在4 425.29 m/z、6 291.06 m/z和7 296.58 m/z出现特征峰。磁珠研磨法相较于其他两种方法所获得的质谱特征峰更复杂，数目更多，强度更高(见图1ⓐ)。对于烟曲霉，磁珠研磨法在质荷比约2 838.80 m/z、5 970.26 m/z、7 088.77 m/z和14 174.93 m/z处均出现特征峰，相较于其他两种方法所获得的特征峰数目更多(见图1ⓑ)。对于土曲霉，三种方法图谱较为相似，但甲酸萃取法在质荷比约5 375.77处出现了峰的左移(见图1ⓒ)。结果表明，磁珠研磨法所获得的蛋白图谱质量优于其他两种方法。

注：ⓐ黄曲霉ATCC3631；ⓑ烟曲霉ATCC MYA 3626；ⓒ土曲霉ATCC MYA 3633。①磁珠研磨法；②冷冻研磨法；③甲酸萃取法

3 讨论

3.1临床上曲霉感染形势不容乐观，其中烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉仍是引起IA最为常见的种类，早期准确的鉴定对于临床诊治具有重要意义[1-3]。目前，MALDI-TOF MS技术可实现部分曲霉的准确鉴定，但曲霉细胞壁含有较多的几丁质成分，壁厚且坚韧，需对其进行前处理使细胞壁充分破裂，胞内核糖体蛋白释放溶出方可用于后续质谱分析[9]。

3.2曲霉质谱蛋白质提取的方法大致分为完整细胞法和细胞裂解法[10-11]。本研究中磁珠研磨法和冷冻研磨法属于细胞裂解法，甲酸萃取法为完整细胞法。国外Lau等[12]采用磁珠法对421株丝状真菌进行蛋白质提取后质谱鉴定，结果显示，370株可鉴定到种的水平(88.9%)。国内宗来斌和吕火烊[13]采用甲酸乙腈提取法和磁珠法对47株曲霉进行前处理后，质谱鉴定率分别为79.8%和77.5%；邓穗燕等[14]研究发现液氮研磨法对35株曲霉种的鉴定率(71%)高于甲酸萃取法(54%)。本实验采用磁珠研磨法、冷冻研磨法和甲酸萃取法三种方法对117株曲霉进行质谱前处理后的总体鉴定率分别为90.60%、61.54%和57.26%，结果与相关报道相近[12，14]，可见磁珠研磨法鉴定率相较于其他两种方法更高，冷冻研磨法与甲酸萃取法鉴定率一般，其中甲酸萃取法鉴定率最低。在鉴定效果方面，磁珠研磨法所获得的平均置信度为90.56%，高于其他两种方法，提示该方法获得的鉴定结果可信程度更高，受试菌株质谱蛋白图谱与图谱库中的图谱匹配程度相关更高。磁珠研磨法所获得的平均峰数目为208，同样高于其他两种方法，可见经该方法前处理后所获得的曲霉蛋白图谱与质谱库中图谱相似度更高。磁珠研磨法对部分菌株所获得的质谱图谱具有特征峰数量更多、强度更强的特点。究其原因，可能是：(1)磁珠研磨法加入了甲酸和乙腈，其中甲酸溶液起到破坏曲霉细胞壁的作用，乙腈则有助于曲霉胞内核糖体蛋白进一步释出[15]；(2)提取过程中加入一定数量的磁珠，磁珠与孢子或菌丝之间相互剪切、碰撞，促使曲霉孢子与菌丝充分研磨，从而达到破壁效果，使得蛋白释放更为充分，一定程度上提高了难破壁菌株的蛋白图谱质量与鉴定效果[16]；(3)随着曲霉的成熟，孢子细胞壁增厚，完整细胞法破壁效果较差，例如本研究中甲酸萃取法鉴定效能较差。本研究中冷冻研磨法与甲酸萃取法总体鉴定率低，鉴定效果差和图谱质量不佳，可能是由于冷冻研磨法中因仪器频率、振荡时间的设置、菌液浓度的差异，振荡过程中未能使孢子、菌丝与磁珠充分混匀，导致破壁效果不佳。甲酸萃取法亦存在破壁不充分的现象，蛋白无法充分释出而影响图谱质量。因此，在后续实验中还需继续摸索和优化曲霉质谱鉴定的各种影响因素，以更好地提高曲霉质谱鉴定率。

3.3丝状真菌细胞壁成分和厚度受生长时期和生长速度影响[17]，不同曲霉生长速度不同，导致细胞壁成分和厚度不同，从而影响破壁效果。本研究发现，不同前处理方法对曲霉的破壁效果存在部分种的差异，实验中三种前处理方法对烟曲霉的鉴定率均在90%以上，鉴定效果和图谱质量优，可见3种前处理方法对烟曲霉鉴定效能影响较小。对于土曲霉、黄曲霉、聚多曲霉和构巢曲霉，只有磁珠研磨法表现出良好的鉴定效能。值得注意的是，磁珠研磨法对于黑曲霉的鉴定率仅为64.29%，平均置信度仅为78.52%，鉴定率相较于其他5种曲霉最低，可能是由于黑曲霉中的黑色素影响了电离作用，造成蛋白质图谱中某些临床菌种特异度峰值的缺乏或峰数目不足，虽能得到蛋白质图谱，但是与数据库比对图谱相似度差，无法获得鉴定结果[15，18]。

3.4操作安全、耗时较短的前处理方法是实验室需要考虑的问题。甲酸萃取法虽耗时最短，相较于磁珠研磨法、冷冻研磨法，省去了菌株灭活的步骤，但可能操作过程中产生的孢子气溶胶会对实验室产生潜在的感染或者污染风险[19-20]，故质谱操作过程必须在生物安全柜内进行且必须对菌株进行灭活。显然，磁珠研磨法虽操作时间较长，但保证了菌株的灭活，在生物安全方面优于甲酸萃取法。

3.5本研究的局限性在于曲霉数量和种类偏少，在今后研究中将继续收集保留菌株，丰富曲霉数量和种类并将其他种类的丝状真菌纳入研究。

综上所述，结合鉴定效果、生物安全和图谱质量三个方面，磁珠研磨法在曲霉的质谱鉴定方面表现较优，鉴定效果较理想，适合于常规实验室对曲霉的快速鉴定，可及时为临床提供病原学依据。