微滴式数字聚合酶链反应在病原体检测中的研究进展

周玉麟， 刘 妍， 夏 勇， 郭旭光

感染性疾病是临床上常见疾病，其快速、明确地诊断病原体有助于提高诊疗效果。近几年，在多种感染性疾病中，病原体定量检测被证明对疾病的预后和监测治疗有重要作用。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,rt-qPCR)作为二代核酸检测方法，已在实验室及临床被广泛使用。但由于很多因素都会影响rt-qPCR的效率，因此rt-qPCR的准确度和精密度可能会有很大的差异。rt-qPCR作为临床常规检测技术存在不足之处，尤其是在复杂背景下检测低含量的靶基因时，需要更加敏感和稳定的方法检测[1]。虽然rt-qPCR已被广泛应用于血清、脑脊液和组织样本的检测，但其灵敏度、准确性和可复制性仍不令人满意。第三代聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)，微滴式数字聚合酶链反应(droplet digital PCR,ddPCR)，是对传统PCR方法的生物技术改进，用于直接量化和克隆扩增DNA。目前广泛应用于低丰度核酸检测，可用于感染性疾病的诊断[2]。ddPCR相较于定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)，其优势是绝对定量的，不需要标准曲线，而且高度可复制的，也不需要对极低浓度下的模板进行预富集。ddPCR通过直接计数阳性孔来计数绝对DNA数量，这在不同的检测中提供了更好的可比性结果[3]。总的来说，ddPCR通常具有更高的灵敏度、更好的准确性和更稳定的性能。近几年的报告确实显示了ddPCR在临床诊断中的应用潜力[3-4]。因此，将ddPCR用于临床研究，对正确诊断和有效治疗具有巨大的优势。其在病原体检测中应用广泛，可用于细菌、真菌、原虫和病毒的快速检测。现将ddPCR技术的发展、原理、优势及在病原微生物检测中的具体应用综述如下。

1 ddPCR的发展及原理

1992年，Sykes最先提出了ddPCR的概念，它是通过将泊松分布和稀释模板结合到单分子水平来定量DNA分子。ddPCR的原理是将与Taqman实验相似的传统PCR混合物，通过加入微孔板、毛细血管或油乳稀释成更小的反应体系[5]。然后这些小的反应体系会单独运行，运行结束后，对所有反应中的阳性反应进行检查和统计。利用小数的泊松定律，模板的数量与阳性反应系呈正相关，从而可以计算出模板的确切拷贝数。近几年报道ddPCR适用于检测低浓度DNA且应用范围广泛，如检测病原体、基因突变、基因拷贝数表达变异、mRNA表达水平和DNA修饰等[2]。如今，越来越多研究证明ddPCR将在临床上广泛应用，其不仅在病原体检测上有特殊优势，还在肿瘤早期相关基因筛查及肿瘤复发风险预测、产前诊断等领域具有潜在优势。

2 ddPCR的优势

2.1更高的精密度和灵敏度 在精准医学的要求下，对病原体核酸的精确测量越来越重要。目前临床上应用广泛的qPCR通过测量PCR扩增物来评估DNA的数量在一定时间点(周期阈值、CT)的荧光信号，将模板分为单个的反应系统，然后在单个孔和DNA中进行过渡PCR，可通过直接计数PCR阳性率进行DNA定量。传统的qPCR通过将样本的CT值与定义明确的样本生成的标准曲线进行比较来定量样本。因此，qPCR通过一种“模拟”方法来确定样品的浓度。利用信号的存在和缺失来指示目标DNA，使样本的“数字”直接测量。相较于qPCR，ddPCR的优势是其测量是绝对定量的，不需要标准曲线，不是通过“模拟”方式得到最终结果，因此结果是高度可复制的[3-4]。由于样品制备和PCR条件的多样性，即使有一个标准曲线显示，qPCR的数据多样性仍高于ddPCR，这导致结果的精密度下降。ddPCR通过直接计数阳性孔来计数绝对DNA数量，这在不同的检测中提供了更好的可比性结果。qPCR的灵敏度因使用的样本类型而差异很大[6]，ddPCR具有较高的灵敏度，不需要对极低浓度下的模板进行预富集[3]，因为ddPCR将样本分成若干个小PCR分区，可实现单分子级检测，避免了模板间的竞争效应，理论上可以提高低丰度目的序列的检测灵敏度，也有实验用于对低浓度的样本进行检测，获得了理想的检测效果[7]。

2.2更高的重复性及通用性 ddPCR不依赖标准品，不需要标准曲线，也不依赖荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，直接计算样品中目的核酸分子的个数，可实现绝对定量，重复性高[8]。因此ddPCR可用于常规qPCR所需的标准品定量，具有计量学意义。ddPCR通用性强，适用样本广泛，ddPCR技术正在各种生物液体中进行研究，例如脑脊液、尿液、粪便、眼液、痰液、唾液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、血清黏蛋白液、腹膜液、细针吸液、胆汁或胰液等。高重复性及高通用性也为其将来运用于临床上提供了更大的可能性。

3 ddPCR应用于病原体检测的范围

3.1病毒学检测 近年来，ddPCR技术的使用率在病毒性疾病诊断中逐渐上升。ddPCR技术对于检测低病毒载量样本具有优势，对于病毒的诊断性能及分析性能也较强，有望成为临床实验室中一种强大的诊断方法。例如识别和检测病毒、病毒载量测定、单拷贝病毒基因组分析、单核苷酸多态性和病毒-宿主相互作用[13-14]。虽然ddPCR仍处于早期阶段，与其他常规方法相比，具有更高的灵敏度和特异度，检测的窗口期更短，意味着能早期明确诊断疾病，为临床治疗带来福音，为疾病防控争取时间。此外，在检测病毒感染疾病中，ddPCR在判断疾病严重程度、监测病程、预测治疗效果及预后方面也发挥着重要作用。在这里，我们列举了一些例子来说明ddPCR在快速准确地检测病毒病原体方面的优势。

3.1.1 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)

世界卫生组织(World Health Organization,WHO)于2020年宣布新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)为全球大流行病。及时准确地检测SARS-CoV-2是有效控制这一流行病的第一步。此外，有证据表明SARS-CoV-2病毒载量在患者住院期间会波动[15]，而更高的SARS-CoV-2水平与疾病严重程度和死亡率增加有关[16]。同时，SARS-CoV-2病毒载量水平与其在接种疫苗和未接种疫苗个体中的传播率密切相关[17]。值得注意的是，病毒载量水平可用于预测患者对治疗的反应。因此准确检测病原体SARS-CoV-2对于防控COVID-19流行和疾病治疗至关重要。目前定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)被WHO和疾病预防控制中心视为诊断SARS-CoV-2的参考标准测试。然而，它的局限性促使人们采用更准确的检测方法来检测SARS-CoV-2，量化其水平和评估预后。大多数研究报告称，在检测和量化SARS-CoV-2水平方面，ddPCR比RT-qPCR诊断更准确，尤其是在病毒载量低的患者中。ddPCR还被发现在量化住院患者的SARS-CoV-2 RNAemia水平、监测病程和预测其对治疗的反应方面非常有效[18]。这些发现表明，ddPCR可以作为SARS-CoV-2检测工具的补充或替代工具，具有良好的诊断、预后和治疗价值，尤其是在医院环境中。但仍需要进一步的研究来对其实验室方案进行标准化，并准确评估其在监测COVID-19治疗反应和识别SARS-CoV-2新兴变体中的作用。越来越多的证据表明，ddPCR对SARS-CoV-2 RNA血浆水平的动态监测与疾病状态(进展或缓解)和对治疗的反应相关。值得注意的是，有研究表明，患者血浆中较高水平的SARS-CoV-2 RNA与疾病进展具有较高的相关性[19]。Szwebel等[20]的研究揭示了ddPCR能够通过检测升高的SARS-CoV-2 RNA血浆水平来预测患者的病情恶化，表明ddPCR可用于监测COVID-19疾病的病程且从血浆中清除病毒有助于患者的临床康复。其研究表明ddPCR能够在74%的住院COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2 RNA血症，而就诊时RNA血症的存在与疾病严重程度、住院时间延长、疾病进展和肺外并发症有关[20]。由此表明，ddPCR是一种高性能模式，对COVID-19患者具有潜在的诊断、预后和治疗价值。但其也有不足之处，ddPCR的灵敏度在不同样本来源之间存在差异，鼻咽拭子中的阳性检出率最高，因此需要进一步关注ddPCR在不同样本中的诊断性能。

3.1.2 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV) 导致获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的HIV在初次感染期间会引起CD4+T细胞的大量损失，这与一般流感没有明显差异[2]。CD8+T细胞随后被激活，同时产生抗HIV抗体，如p24抗体，用作HIV感染的临床标志物。由于HIV原发感染期和无症状潜伏期有流感样症状，直到晚期HIV感染发生机会性感染，患者就医后才被诊断出HIV感染。血清学方法在初级或潜伏期有用，但是其难以成为高危人群的日常测试[21]。基于qPCR的方法广泛用于HIV检测，包括线性拷贝DNA(complementary DNA,cDNA)、2-LTR环和整合HIV DNA[22]。自2012年以来，有研究证明ddPCR可用于检测总HIV DNA、2-LTR环和病毒RNA[23]。使用ddPCR检测血浆HIV RNA可以更好地早期诊断HIV感染。与qPCR相比，ddPCR在通过总HIV DNA和2-LTR环确定疾病进展和抗病毒治疗效果中的应用显示出更高的灵敏度和准确性[24-26]。ddPCR还可通过测量CCL4L的拷贝数来预测HIV感染和疾病进程的结果，CCL4L编码CCR5的配体并作为HIV感染的抑制剂[27]。但在检测HIV病毒载量时，仍有一些无法解释的假阳性事件被报告[28]。显然，通过个性化检测，ddPCR将成为诊断HIV的强大而有效的平台。WHO报告称，截至2018年底，全球有3 790万人被诊断出感染HIV，其中62%(2 330万人)正在接受抗逆转录病毒治疗。根据WHO指南，抗病毒治疗旨在减少病毒的拷贝数低于1 000 copies/ml[29]。病毒载量监测是验证抗逆转录病毒治疗效果的推荐筛查方法[30]。虽然ddPCR在HIV检测及治疗监测上都有重要意义，但其在HIV病毒载量中的应用仍存在争议，需要更多的实验研究去证明其具有灵敏性和稳定性等优势，才能普遍应用于诊断实验室。

3.1.3 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) 病毒性肝炎乙型肝炎是由HBV引起的传染病，通过接触受感染的血液或体液传播。大多数慢性病患者没有症状，然而有些患者最终会发展成肝硬化和肝细胞癌。对早期感染HBV的患者进行可靠诊断可以有效防止患者病情恶化。乙型肝炎抗原或抗体是现代医院诊断HBV感染最常见的生物标志物。乙型肝炎表面抗原是HBV感染期间第一个可检测到的病毒抗原，但它可能既不存在于感染早期，也不存在于感染后期，因为宿主免疫系统一直在持续清除它[2]。因此，需要一种可用于改善HBV检测的新颖、灵敏且特异的检测手段。ddPCR为肝炎病毒核酸的鉴定和定量提供了新的视野。ddPCR的使用为监测接受联合治疗的肝炎感染者提供了一种有前景的方法。ddPCR是一种强大的检测工具，甚至可以测量低至一个拷贝的HBV DNA[31-32]，其低检测限和定量限分别为0.8拷贝/105个细胞和3.8拷贝/105个细胞；而对于qPCR相应的检测指标分别为19.1拷贝/105个细胞和71.1拷贝/105个细胞。根据欧洲肝脏研究协会(European Association for the Study of the Liver,EASL)2017临床实践指南，治疗期间的病毒学应答被定义为无法检测到的HBV DNA，其检测限为10 IU/ml[33]，这是传统检测方法可检测到的最低实际值。HBV的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，已成为隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)和肝细胞癌的新型预后生物标志物。所有HBV RNA分子均来源于cccDNA，其存在于慢性HBV感染患者的肝细胞中。ddPCR可以提高HBV DNA的DNA检测限，且线性度较高[31，34]。和其他病毒相似，通过RT-ddPCR和RT-qPCR检测HBV RNA拷贝数证明了高度的线性和定量相似性。越来越多的证据表明，ddPCR是一种高度准确的技术，其精准度和重现性较传统的qPCR方法更高。对此进行进一步优化仍然需要确定该方法对低病毒载量临床样品的性能，特别是在OBI和细胞治疗方法中的性能，这也将为HBV感染的诊断与治疗带来巨大前景。

3.1.4 其他病毒 ddPCR超灵敏技术是一种通用的方法，除了上述病毒以外，还可以用于检测其他病毒，如巨细胞病毒、流感病毒等。ddPCR对于低病毒载量的巨细胞病毒样本具有很好的检测效果，因其灵敏度与特异度高，且对于错配引物的抵抗力强，也具有较高的重复性[35]。流感病毒是临床上常见的病毒，使用ddPCR去检测流感病毒技术也很成熟，尤其是最近开发了一种具有成本效益的六重ddPCR来检测甲型流感病毒(H1、H3和M)和乙型流感病毒(Yamagata HA、Victoria HA和M)单一反应混合物中的片段，推动了快速检测领域的发展[35]。ddPCR开辟了病毒检测的新领域，随着技术的不断发展，之后也会用于更多类型的病毒检测。

3.2细菌学检测 细菌是许多疾病的病原体，可以通过多种方式在正常人体间传播，具有较强的传染性，对社会危害很大，所以从可疑样本中快速准确地检测致病细菌至关重要。然而，传统的基于培养的细菌检测方法时间周期较长，需要更快速的方法来进行检测。目前已经开发了多种诊断技术，特别是基于PCR的方法可快速检测病原体。目前应用于检测的常用PCR的方法主要有普通PCR、rt-qPCR及多重PCR，普通PCR及rt-qPCR早已被广泛接受。而相比于普通PCR及rt-qPCR，多重PCR能够同时检测多个基因的特点，曾引起广泛关注，但其受到引物及靶标设计等诸多因素影响，限制了其发展[36]。因常用的PCR方法检测细菌的局限性，近几年开发了ddPCR以寻求更灵敏、准确及可重复的检测方法。早在2017年，就已经有研究组开发了多重单完整细胞ddPCR检测技术来检测肠出血性大肠杆菌，这是在单个完整细菌细胞内检测两个遗传靶标的新方法，包括肠出血性大肠杆菌的志贺毒素stx和紧密素eae。将此技术应用于富集培养筛选可以减少假阳性的出现，提高了食品中肠出血性大肠杆菌检测方法的速度和准确性，降低了检测成本。然而，此研究方法只有双遗传靶标，而且扩增效率较低。之后，Lei等[37]开发了一种基于tlh、tdh和ureR基因引物和探针序列的三重ddPCR方法，用于对副溶血性弧菌细胞进行检测和基因分型。而后，在此基础上更是建立了一种四重ddPCR方法，可以同时检测食品样品中的tlh、tdh、ureR和orf8基因，用于检测具有单个完整细胞的副溶血性弧菌。将这些基因的4个探针用2种荧光染料标记，探针浓度按比例分布形成16(24)簇，从而明确显示和量化含有1个/2个/3个/4个特定基因的液滴，对应于单个完整细菌细胞的基因类型。该四重ddPCR测定的灵敏度为39 CFU/ml，灵敏度与传统的平板计数一致，并且比qPCR的灵敏度高10倍。因此，此四重ddPCR方法可以快速准确地检测副溶血性弧菌(包括大流行组菌株)，且特异性强、灵敏度高，可用于多种样品中副溶血性弧菌的分化，并为检测其他细菌提供一种新的方法[38]。之后，更有研究建立了一种多重ddPCR方法，可以同时检测5种高风险细菌，包括鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌、布鲁氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌以及土拉弗朗西斯菌。多重检测结果表明，该方法对于5种细菌的检测限较低(0.1～1.0 pg/μl)，且特异度高。同时，由于某些菌株中可能不存在质粒，这项研究建立的多重ddPCR测定主要集中在染色体上的基因(单拷贝基因)而不是5种细菌的质粒基因上[39]。除此之外，ddPCR检测技术可以对呼吸道标本中结核分枝杆菌进行鉴定及定量，大大改善了涂片检测结核分枝杆菌的诊断[40]；还可以对感染样品中的“亚洲念珠菌”和柠檬螺旋体进行绝对定量和检测[41]；也可以双重检测黄杆菌属及鲁氏耶尔森菌，用于监测水样中的病原体水平[42]。之后，更有研究人员在此基础上建立了一种四重复合物测定法，包括新西兰立克次氏体类生物体1(New Zealand rickettsia-like organism 1,NZ-RLO1)、新西兰立克次氏体类生物体2(New Zealand rickettsia-like organism 2,NZ-RLO2)、海洋屈挠杆菌和鲁氏耶尔森菌，为水产养殖提供了一种快速高效的病原体筛选工具[43]。

3.3真菌学检测 真菌培养是目前鉴定真菌的普通方法，而随着分子生物学的出现，真菌的检测技术有了很大的发展。PCR检测技术极大地提高了常见致病真菌的检测速度，且特异性较好，敏感度较高。近年来，快速发展的ddPCR检测技术也在真菌的鉴定中发挥了巨大的作用。(1)念珠菌是常见的一种真菌，在发病率增高的同时死亡率也逐年增加，对此侵袭性真菌感染的快速准确诊断有助于感染患者的早期治疗和改善预后。传统的血培养方法周期过长，而在感染后临床通常经验性使用广谱抗生素，这会增加一些不必要的成本以及不良预后。Chen等[44]通过分析感染小鼠和疑似念珠菌血症患者的血液样本，来评估ddPCR方法在体外和体内检测念珠菌DNA的敏感度和特异度。结果表明，ddPCR对念珠菌DNA检测的敏感度和特异度均高于传统培养和qPCR方法，且重现性好。因此，ddPCR测定有可能是及时诊断念珠菌血症的有效方法，可以用于监测念珠菌血症的治疗。(2)耶氏肺孢子菌是一种人类特异性机会性真菌，可引起肺孢子虫肺炎，是HIV患者常见的机会性感染病原体。但由于耶氏肺孢子菌无法培养，因此确诊需要通过染色法来检测鉴定病原体或者通过呼吸道标本的PCR检测，但这些方法都很可能受到病原体载量的影响。有研究开发了一种ddPCR方法来检测呼吸道标本中的耶氏肺孢子菌并评估其敏感性。ddPCR与qPCR这两种方法都可以检测耶氏肺孢子菌DNA，但相较于后者来说，前者对病原体载量较低的标本显示出更好的敏感性[45]。尽管ddPCR具有很多优点，但这两项研究都仅使用一个靶标来评估qPCR与ddPCR测定的性能。(3)烟曲霉菌和土曲霉菌在支气管扩张症等慢性呼吸道疾病状态中具有重要的作用，目前大多数可用的曲霉菌相关诊断试剂盒不能专门检测生物样品中的烟曲霉菌和土曲霉菌，通常采用全曲霉菌方法的引物和探针，但会在几种曲霉菌物种之间发生交叉反应。该研究开发了双重TaqMan引物和探针来评估ddPCR技术检测正常及患病人群的呼吸道标本。虽然qPCR和ddPCR这两种方法都能检测烟曲霉菌和土曲霉菌，但结果表明，相较于qPCR，ddPCR对检测这两种曲霉菌具有更高的敏感性，并且对PCR抑制更具有抵抗力，尤其在土曲霉菌丰度很低的情况下更加明显[46]。除上述真菌外，ddPCR检测技术能联合检测大丽轮枝菌及甘蓝轮枝菌，其准确性及灵敏度都高于qPCR[47]；还可以分析黄曲霉毒素和非黄曲霉毒素菌株的竞争和相互作用机制[48]；还能检测面包上的异常威克汉姆酵母菌和扣囊复膜酵母菌，灵敏度高，可以用来监测面包质量[49]。

4 前景与展望

ddPCR是常规PCR方法的生物技术改进，作为一种新技术，近几年发展越来越成熟，应用越来越广泛。其有着高效的诊断性能，有其独特的优势，可用于直接定量和克隆扩增DNA，对感染性疾病的诊断、病情监测及预后评估有重要作用。尽管如此，ddPCR在感染性病诊断中还没有实际应用于临床，需要更多的临床样本来测试ddPCR的性能。最重要的是，与qPCR相比，ddPCR机器和试剂的成本相对较高，这使得它难以在医院的一般实验室中普及。未来，当ddPCR检测成本下降时，其在医院和实验室中的应用将会越来越多。