涂片抗酸染色T-SPOT.TB与GeneXpert MTB/RIF联合检测在结核病诊断中的应用价值分析

赵 丽， 胡黎梅， 袁育林， 梁 亮， 蒋 洁

由结核分枝杆菌感染所致的结核病是人类传染病的主要死亡原因之一[1]。《2021年全球结核病报告》中指出2020年全球新发结核病患者约为987万例，约有150万例死于结核病。我国新发结核病患者为84.2万例，仅次于印度，位于全球第二，结核病对公共卫生构成了严重威胁[2]。结核分枝杆菌感染的早期快速诊断是有效控制结核病的重要手段。目前，用于结核病诊断或辅助诊断的实验室方法包括针对结核分枝杆菌病原体检测的涂片法、结核分枝杆菌培养、分子生物学法；基于免疫反应的结核抗体检测、结核菌素皮肤试验、γ-干扰素释放试验[结核感染T细胞斑点试验(T-cell spot of tuberculosis assay,T-SPOT.TB)]等。2022年发布了《综合医院结核分枝杆菌感染实验室检查共识》[3]，要求综合医院应常规开展涂片镜检辅助结核病的诊断，建议开展γ-干扰素释放试验分枝杆菌感染的诊断，有条件的实验室开展分子生物学检测。本研究通过回顾性分析临床诊断为结核病患者和非结核病患者采用涂片抗酸染色(涂片法)、T-SPOT.TB、结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert MTB/RIF)三种方法的检测结果及病例资料，进一步评估三种方法单独和联合检测对结核病诊断的应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2021年12月至2022年9月在广西壮族自治区人民医院同时进行涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF检测的临床疑诊结核分枝杆菌感染患者的检测结果以及病例资料，共298例。排除陈旧性结核、无法确诊是否为结核分枝杆菌感染的患者31例，最终纳入267例。

1.2分组方法 (1)结核组：根据肺结核诊断标准(WS288-2017)[4]，①临床诊断病例：经鉴别诊断排除其他肺部疾病。成人：胸部影像有活动性肺结核相符的病变并伴有以下任意一条，a.有肺结核症状；b.结核菌素试验中度以上阳性；c.γ-干扰素释放试验阳性；d.结核抗体检查阳性；e.肺外组织病理为结核病变；f.支气管镜镜下符合结核病改变。儿童：胸部影像学有活动性肺结核相符的病变；伴有肺结核可疑症状；伴结核菌素试验中度以上阳性或γ-干扰素释放试验阳性。②确诊病例：痰涂片阳性肺结核(符合以下三项之一)，a.2份痰涂片抗酸杆菌检查阳性；b.1份痰涂片抗酸杆菌检查阳性+胸部影像有活动性肺结核相符的病变；c.1份痰涂片抗酸杆菌检查阳性+1份痰分枝杆菌培养阳性。仅分枝杆菌分离培养阳性肺结核：胸部影像有活动性肺结核相符的病变且仅结核分枝杆菌培养阳性。分子生物学阳性肺结核：胸部影像有活动性肺结核相符的病变且仅分枝杆菌核酸检测阳性。肺组织病理学阳性肺结核：肺组织病理符合结核病病理改变。最终临床确诊结核患者共74例。(2)非结核组：经相关检查及治疗后排除结核感染的患者193例。两组年龄、性别构成比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组年龄、性别比较[n(%)，M(P25，P75)]

1.3检验方法

1.3.1 涂片法 取干净容器收集清晨的深咳痰、支气管镜检灌洗液、胸水等标本，采用萋-尼抗酸染色，按《结核病实验室检验规程》[5]进行涂片染色镜检及结果判读。

1.3.2 T-SPOT.TB 抽取患者足量的外周静脉血置于肝素抗凝管中，于4 h内进行外周血单个核细胞分离后严格按照结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒(Oxford Immunotec，英国)说明书操作。结果判断标准：阳性对照孔正常，空白对照孔斑点数为0～5个，抗原A或抗原B孔的斑点数-空白对照孔斑点数≥6个，结果判读为阳性。若空白对照孔斑点数为6～10个，抗原A或抗原B孔的斑点数≥2×空白对照孔斑点数，结果亦判读为阳性。若不符合以上标准，结果则判读为阴性。

1.3.3 GeneXpert MTB/RIF 不同标本的前处理：(1)痰、气管吸物：取1 ml痰标本放置到旋盖锥形管中，加入2 ml样本处理液，使用涡旋仪振荡15～30 s，室温静置10 min；再次使用涡旋仪振荡10 s，室温静置5 min，直至痰液充分液化。(2)肺泡灌洗液：将灌洗液(>5 ml)转移至锥形离心管中，3 000 g离心15 min，弃上清，加入2 ml样本处理液并涡旋振荡，重悬沉淀物，充分混匀。(3)胸水、腹水、脑脊液：将胸水、腹水、脑脊液转移至锥形离心管中，3 000 g离心15 min，弃上清，加入2 ml样本处理液并涡旋振荡，重悬沉淀物，充分混匀。将2 ml处理好的标本加入反应盒，应用GeneXpert检测系统(美国Cepheid公司)进行检测。系统可自动判读待测样本是否检出结核分枝杆菌复合群及利福平的耐药情况。

1.4统计学方法 应用SPSS26.0统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料以中位数(下四分数，上四分位数)[M(P25，P75)]表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数(百分率)[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF单项检测诊断效能比较 涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF检测的灵敏度分别为43.2%、94.6%、63.5%，比较差异有统计学意义(χ2=44.861，P=0.000)；特异度分别为99.5%、66.3%、100.0%，其中涂片法与GeneXpert MTB/RIF特异度比较差异无统计学意义(χ2=0.000，P=1.000)，而T-SPOT.TB检测特异度低于涂片法和GeneXpert MTB/RIF，差异有统计学意义(χ2=74.861，P=0.000；χ2=78.162，P=0.000)。GeneXpert MTB/RIF的准确率最高，为89.9%，三种方法检测准确率比较差异有统计学意义(χ2=23.468，P=0.000)。见表2。

表2 涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF单项检测诊断效能比较[%(n/N)]

2.2涂片法分别联合T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF检测诊断效能比较 联合实验诊断过程中，两种方法中有一种方法为阳性即诊断为阳性。267例患者均接受了三种方法检测，涂片法联合T-SPOT.TB检测的灵敏度与涂片法相比，差异有统计学意义(χ2=45.548，P=0.000)。涂片法联合GeneXpert MTB/RIF检测的灵敏度与涂片法相比，差异有统计学意义(χ2=6.965，P=0.008)。见表3。

表3 涂片法分别联合T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF检测诊断效能比较[%(n/N)]

3 讨论

3.1结核病因其高发生率、易传染、发病隐匿以及临床症状无特异性造成社会极大的疾病负担[6]。因此，早期快速诊断结核分枝杆菌的感染对于有效控制结核病传播、减轻社会疾病负担具有重要意义。本研究通过回顾性分析我院2021年12月至2022年9月同时进行涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF三种方法的患者检测结果以及病例资料，评估其诊断效能，为临床快速诊断结核病提供思路。

3.2涂片法是结核病确诊应用最广泛的实验室诊断方法[7]。其基于结核分枝杆菌细胞壁内含有大量脂质与石碳酸复红结合后能够抵抗酸性酒精的脱色作用致使菌体保持红色这一特性对结核分枝杆菌进行鉴定，简单快速、成本低廉、可行性高。以往研究显示涂片法易受标本含菌量(每毫升样本含菌量达5 000～10 000条时才可检出阳性)、操作人员技术水平影响，阳性率低，仅为14%～47%[8-9]。本研究结果显示涂片法的灵敏度为43.2%，在三者中最低，进一步说明了涂片法容易造成临床漏诊。本研究中涂片法特异度为99.5%，193例非结核患者中有1例涂片法结果阳性而经二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)诊断为非结核分枝杆菌感染，提示涂片法无法区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，易引起临床误诊。陈蕾等[10]研究发现我国非结核分枝杆菌感染率逐年上升。杨栗坤等[11]指出非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌感染所致的临床症状、肺部影像学表现十分相似。非结核分枝杆菌对临床治疗结核药物表现出耐药性，杨燕和曾谊[12]研究表明非结核分枝杆菌对一线抗结核药物异烟肼、利福平、链霉素以及二线抗结核药物对氨基水杨酸、卡那霉素、左氧氟沙星的耐药率均超过90%。若临床将非结核分枝杆菌感染误诊为结核病，其治疗效果差，且延误病情致使患者预后差。

3.3T-SPOT.TB是以结核分枝杆菌RD1区编码的早期分泌抗原靶6(early secretory antigenic target 6,ESAT-6)、培养滤液蛋白10(culture filtrate protein-10,CFP10)作为刺激源刺激存在于结核分枝杆菌感染患者体内的效应T细胞分泌γ-干扰素，并联合酶联免疫斑点技术检测是否感染结核的免疫学方法。检测标本为外周静脉血，对不易咯痰的患者具有优势；不受患者排菌状态、排菌数量的影响，灵敏度高；且不与环境分枝杆菌、卡介苗发生交叉反应。本研究中，T-SPOT.TB的灵敏度为94.6%，三者中最高；特异度为66.5%，三者中最低。比尹洪云等[13]研究中对不同人群T-SPOT.TB检测的灵敏度(82%～84%)和特异度(53%～54%)都高。临床应用T-SPOT.TB辅助诊断结核感染时需考虑假阳性的可能。假阳性的原因包括堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、戈登分枝杆菌的存在[14-15]。在本研究中，3例T-SPOT.TB检测结果为阳性的非结核患者中，1例NGS诊断为龟分枝杆菌感染，2例NGS诊断为脓肿分枝杆菌感染，这与以往文献报道不一致，需进一步研究。另外，研究表明T-SPOT.TB具有较高的阴性预测值[16]，阴性结果对于排除结核病具有重要意义。但需注意T-SPOT.TB实验与机体内效应T细胞的数量和功能密切相关[17]。患者免疫系统发育不完善或免疫系统遭到破坏时易出现T-SPOT.TB实验结果假阴性。本研究中有3例T-SPOT.TB阴性的结核患者，2例起病急，考虑可能为感染早期导致的假阴性；另1例为20岁年轻女性，免疫功能正常，发病20 d检测结果显示假阴性，胸水GeneXpert MTB/RIF检测阳性。假阴性结果原因有待进一步研究。

3.4GeneXpert MTB/RIF是世界卫生组织推荐的结核病检测分子诊断方法[18]，2017年发布的《中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断》[4]将其纳入肺结核的诊断标准。其检测快速，2 h即可完成[19]。Wang等[20]指出GeneXpert MTB/RIF的灵敏度比涂片法、培养法高，约为53.54%；能够准确区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，特异度近100%[21]。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF的检测灵敏度为63.5%，与文献报道相比灵敏度略高，造成这种差异的原因可能是地区、研究样本总数的不同。该法特异度为100.0%。因此，当患者涂片法结果为阳性而GeneXpert MTB/RIF检测结果为阴性时，提示医师应高度怀疑患者感染非结核分枝杆菌，及时对患者进行非结核分枝杆菌相关检查并调整治疗方案。此外，GeneXpert MTB/RIF能够检测结核分枝杆菌对利福平的耐药情况，其灵敏度为66.7%，特异度为100.0%[22]。值得注意的是，rpoB基因的沉默突变会导致GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌对利福平的耐药情况出现假阳性[23]。

3.5本研究结果显示，三种方法中GeneXpert MTB/RIF的准确率(89.9%)、特异度(100.0%)和阳性预测值(100.0%)最高，T-SPOT.TB的灵敏度(94.6%)和阴性预测值(97.0%)最高，T-SPOT.TB或GeneXpert MTB/RIF检测的灵敏度显著高于涂片法。采用T-SPOT.TB或GeneXpert MTB/RIF联合涂片法均可显著提高结核病诊断的灵敏度。T-SPOT.TB和GeneXpert MTB/RIF还具有快速检测的特性，可大大缩短检测时间。

综上所述，综合医院应根据实际情况进行多种结核病诊断方法的联合检测，能有效提高结核病的快速实验室诊断能力，及时协助临床制定抗感染方案，遏制结核感染性疾病的传播。