黄芪甲苷对脓毒症小鼠急性肾损伤的保护作用及机制

张玉明，亢德强，徐臣年，唐赛男，罗明华，李 婕，乔 锐*

(1联勤保障部队第967医院心肾内科，大连 116021；2武警四川省总队医院泌尿外科；3北部战区总医院干部病房一科；*通讯作者,E-mail:2981703671@qq.com)

流行病学研究揭示了重症监护患者急性肾损伤和脓毒症之间不可避免的联系。继发于脓毒性损伤的肾功能障碍的发生通常会对住院患者的预后产生极其不利的影响[1,2]。不幸的是，除了持续肾脏替代疗法或肾脏移植之外，还没有有效的方法应用于治疗脓毒症诱导的肾损伤的临床试验[3]。脓毒症诱导的肾损伤的病理生理机制是复杂的，尚未完全阐明。越来越多的证据表明，脓毒症引起的促炎因子和抗炎因子水平的变化会导致炎症反应，从而导致急性肾损伤[4,5]。此外，来自实验模型和临床研究的数据也支持氧化应激和活性氧增加在脓毒症诱导的急性肾损伤进展中的关键作用。

黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是从中药黄芪中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎症、降低血糖等多重药理作用[6]。值得注意的是，黄芪甲苷在多种损伤因素所致的肾脏疾病尤其是对糖尿病肾病的保护作用被越来越广泛地报道[7-9]。然而黄芪甲苷能否减轻脓毒症小鼠急性肾损伤及其治疗机制尚未完全清楚，因此，本研究通过构建脓毒症小鼠模型，以初步观察黄芪甲苷对脓毒症小鼠急性肾损伤的保护作用，并探讨其潜在的分子机制，为其在肾病防治中的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验动物

无特定病原体(SPF)雄性C57BL/6J小鼠40只，8周龄。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)购于美国Sigma-Aldrich公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione,GSH)检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。TUNEL凋亡检测试剂盒购于美国Roche公司。超氧化物阴离子荧光检测探针购于美国ThermoFisher公司。SIRT1抗体和β-actin抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。多功能酶标仪购于美国Thermo公司，倒置显微镜购于日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 C57BL/6J小鼠被随机分为4组：假手术组(sham)、黄芪甲苷组(sham+AS-Ⅳ)、模型组(CLP)和模型+黄芪甲苷处理组(CLP+AS-Ⅳ)。应用盲肠结扎穿孔手术建立脓毒症模型。所有动物在手术前12 h禁食，可自由饮水。通过腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠。在腹部中线切开1 cm以暴露盲肠。用丝缝线在回盲瓣下方的底部将盲肠紧紧结扎，用20G的穿刺针在盲肠上扎穿两次后，轻轻挤出少量粪便。此后，将盲肠放回腹膜腔，用无菌缝线缝合腹部。sham组小鼠进行与CLP组相同的剖腹手术，但不结扎和穿刺盲肠。sham+AS-Ⅳ组和CLP+AS-Ⅳ组小鼠术后腹腔注射黄芪甲苷(100 mg/kg)治疗，sham组和CLP组小鼠术后给予腹腔注射等体积生理盐水处理。术后处理24 h采集血、尿等样本并处死小鼠。

1.2.2 肾功能指标测定 使用酶标仪收集血样以测量血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)水平。根据各个ELISA试剂盒提供的说明，收集尿样以测量肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和尿白蛋白/肌酐(urinary albumin/creatinine，UAlb/Cr)的表达水平。

1.2.3 肾脏组织染色 小鼠肾脏经多聚甲醛固定和石蜡包埋后切成3 μm厚的切片。然后进行苏木精-伊红(HE)染色以观察肾组织的形态学变化。用倒置显微镜捕捉每个切片中随机选择的5个高倍视野。使用以下参数对肾组织的损伤量化进行分级：细胞水肿、细胞凋亡、坏死细胞增多、炎性细胞浸润和出血。采用半定量量表对肾脏损伤进行评分，并进行统计分析。

1.2.4 SIRT1,肾组织促炎因子及凋亡指标表达测定 使用TRIzol试剂从肾组织中提取总RNA。此后，使用高容量cDNA逆转录试剂盒按照说明书的方案合成cDNA。CFX96 RT-PCR系统用于qRT-PCR程序。靶基因的相对水平用2-ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。

表1 相关引物序列

1.2.5 肾组织MDA含量、SOD和GSH活性测定 根据试剂盒说明书，采用ELISA方法测定肾组织中MDA含量、SOD和GSH活性，使用SpectraMax M5装置对结果进行分光光度分析。

1.2.6 肾组织ROS生成测定 肾脏在液氮中快速冷冻，并切成3 μm厚的切片。冷冻组织切片在黑暗潮湿的小室中用二氢乙锭(ethidium dihydrochloride，DHE)反应混合物染色。使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜检查每个样品。使用ImageJ软件测定切片中二氢乙锭的荧光强度，以评估肾组织中ROS的产生。

1.2.7 肾组织细胞凋亡检测 小鼠肾脏经多聚甲醛固定和石蜡包埋后切成3 μm厚的切片。经脱蜡水化和PBS液浸洗后，用Proteinase K进行细胞通透处理。按照试剂盒说明书制备TUNEL反应混合液，滴加于标本上，加盖玻片在37 ℃暗湿盒中反应1 h。PBS洗涤后加入DAPI染色液1 ∶2 000室温孵育5 min。使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜观察每个样品，其中蓝色荧光表示总细胞核，绿色荧光表示凋亡细胞核，以发绿色荧光细胞数占蓝色荧光细胞数的百分比(%)表示细胞的凋亡率。

1.2.8 SIRT1蛋白表达及脱乙酰酶活性检测 从肾组织中提取总蛋白，并使用BCA试剂盒进行定量。通过SDS-PAGE分离蛋白样品，然后转移至聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h后，将膜在SIRT1(1 ∶1 000)、和β-actin(1 ∶5 000)的一抗中4 ℃孵育过夜。经漂洗后再将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗一起孵育，并使用Image Lab分析蛋白条带。

SIRT1脱乙酰酶活性根据制造商的说明书通过荧光测定法进行测量。向每个孔中加入显色剂Ⅱ后，将反应混合物在37 ℃下使用SpectraMax M5仪器读取荧光，激发波长为360 nm，发射波长为460 nm。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪甲苷显著减轻脓毒症小鼠肾功能损伤

与sham组相比，CLP组小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr水平均明显升高(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr均显著降低(P<0.05)；而与sham组相比，sham+AS-Ⅳ小鼠上述肾功能指标差异无统计学意义(P>0.05，见图1)，提示黄芪甲苷能够减轻脓毒症小鼠肾功能损伤。

与sham组相比，*P<0.05；与CLP组相比，#P<0.05图1 各组小鼠的肾功能比较Figure 1 Comparison of renal function between groups

2.2 黄芪甲苷显著减轻脓毒症小鼠肾组织结构损伤

sham组和sham+AS-Ⅳ组小鼠肾组织结构无明显改变，无肾小球肿胀、坏死及肾小管内铸型形成(P>0.05)；CLP组小鼠肾组织可见明显的肾组织结构改变，如肾小球肿胀、坏死及肾小管内铸型形成，肾组织损伤评分显著升高(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织结构改变明显得到减轻，肾组织损伤评分显著降低(P<0.05，见图2)。提示黄芪甲苷显著减轻脓毒症小鼠肾组织结构损伤。

图2 各组小鼠的肾组织结构变化比较 (HE染色)Figure 2 Comparison of changes of renal tissue structure between groups (HE staining)

2.3 黄芪甲苷显著减轻脓毒症小鼠肾组织炎症反应及凋亡水平

与sham组相比，CLP组小鼠肾组织中SIRT1表达水平明显降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及凋亡指标Bax、Caspase-3的mRNA表达显著升高(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中SIRT1表达水平明显升高(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及凋亡指标Bax、Caspase-3的mRNA表达明显减少(P<0.05)；而与sham组相比，sham+AS-Ⅳ组小鼠上述SIRT1、促炎因子以及凋亡指标的表达差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。提示黄芪甲苷可减轻脓毒症小鼠肾组织炎症反应及凋亡水平。

与sham组相比，*P<0.05；与CLP组相比，#P<0.05图3 各组小鼠肾组织炎症反应水平比较Figure 3 Comparison of inflammatory response levels in renal tissue between groups

2.4 黄芪甲苷显著减轻脓毒症小鼠肾组织氧化应激损伤

与sham组相比，CLP组小鼠肾组织中ROS生成量和MDA含量显著增加，SOD和GSH的含量显著减低(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中ROS生成量和MDA含量显著降低，SOD和GSH的含量显著升高(P<0.05)；而与sham组相比，sham+AS-Ⅳ组小鼠上述氧化应激指标差异无统计学意义(P>0.05，见图4)。提示黄芪甲苷可减轻脓毒症小鼠肾组织氧化应激损伤。

与sham组相比，*P<0.05；与CLP组相比，#P<0.05图4 各组小鼠肾组织氧化应激水平比较Figure 4 Comparison of renal oxidative stress level between groups

2.5 黄芪甲苷显著降低脓毒症小鼠肾组织细胞凋亡率

与sham组相比，CLP组小鼠肾组织细胞凋亡率明显上升(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织细胞凋亡率明显下降(P<0.05)；而与sham组相比，sham+AS-Ⅳ小鼠肾组织细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05，见图5)。提示黄芪甲苷显著降低脓毒症小鼠肾组织细胞凋亡率。

与sham组相比，*P<0.05；与CLP组相比，#P<0.05图5 TUNEL染色检测各组小鼠肾组织凋亡率Figure 5 Apoptosis level in renal tissue in each group by TUNEL staining

2.6 黄芪甲苷显著促进脓毒症小鼠肾组织SIRT1信号表达及凋亡水平

与sham组相比，CLP组小鼠肾组织中SIRT1蛋白的表达及去乙酰化活性均显著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3表达水平显著增加(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中SIRT1蛋白的表达及去乙酰化活性均显著增加(P<0.05)，Bax、Caspase-3表达水平显著降低(P<0.05)；而与sham组相比，sham+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中SIRT1蛋白的表达及去乙酰化活性、Bax、Caspase-3表达水平差异无统计学意义(P>0.05，见图6)。提示黄芪甲苷能够促进脓毒症小鼠肾组织SIRT1信号表达及凋亡水平。

与sham组相比，*P<0.05；与CLP组相比，#P<0.05图6 蛋白免疫印迹检测各组小鼠肾组织SIRT1信号表达Figure 6 SIRT1 signal expression in renal tissue in each group by Western blot

3 讨论

急性肾损伤是一种复杂的临床综合征，其定义为血清肌酐水平的快速增加和肾脏排泄功能的突然丧失，被视为与重症患者死亡率升高相关的主要公共卫生问题[10,11]。尽管肾脏替代疗法取得了技术进步，但大多数患者仍然存在不良结果和严重的肾功能损害[3]。据报道，脓毒症是危重患者急性肾损伤的重要诱因。比较研究表明，脓毒症诱导的急性肾损伤患者其肾功能变化更明显，肾脏组织学变化更剧烈，且总死亡率更高[12]。因此，迫切需要开发有效的治疗策略来缓解并改善这种严重临床并发症的预后。

近年来多项研究发现，一种来源于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的黄酮类化合物黄芪甲苷，在肾脏相关疾病中发挥了重要的保护作用[13,14]。然而，黄芪甲苷能否减轻脓毒症急性肾损伤及其潜在分子机制还有待进一步探究。在本研究中，我们同样发现，与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠的BUN、Scr、KIM-1、UAlb/Cr均显著降低，且CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织结构改变明显得到缓解。以上结果提示，黄芪甲苷对抑制脓毒症引起的急性肾损伤具有巨大的治疗潜力。

目前，脓毒症诱导的急性肾损伤机制是复杂的。来自实验模型和临床研究的证据表明，炎症在脓毒症诱导的急性肾损伤中起着至关重要的作用[4]。全身性脓毒症发生后，炎症细胞因子和白细胞活性的增加导致肾脏进一步的促炎反应，从而导致微循环障碍、内皮细胞功能障碍和功能障碍性肾小管-肾小球反馈，最终导致肾脏损伤[15]。因此，减轻炎症反应将是治疗脓毒症诱导的急性肾损伤的一个关键策略[16]。在本研究中，我们发现与sham组相比，CLP组小鼠肾组织中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-Α以及凋亡相关指标Bax、Caspase-3的mRNA表达显著升高；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中上述促炎因子和凋亡相关指标的表达明显减少，这表明黄芪甲苷可以通过其抗炎作用保护脓毒症诱导的急性肾损伤。

由过量ROS引发的氧化应激水平升高是急性肾损伤进展的另一个重要机制。持续增强的氧化应激过度消耗内源性抗氧化酶，导致膜脂过氧化、蛋白质和DNA氧化，最终导致细胞结构和功能的破坏以及肾组织的损伤[17,18]。在我们的研究中，与sham组相比，CLP组小鼠肾组织中ROS生成量和MDA含量显著增加，SOD和GSH的含量显著减低，与先前的研究结果相一致。大量研究发现，抑制氧化应激是缓解脓毒症诱导的急性肾损伤的重要方法。我们的结果还观察到，与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中ROS生成量和MDA含量显著降低，SOD和GSH的含量显著升高。这表明黄芪甲苷不仅可以抑制过量ROS的产生，还可以恢复抗氧化系统的功能，突出了其在减轻脓毒症小鼠肾组织氧化损伤方面的潜力。

当遇到诸如败血症、局部缺血和毒物等损伤时，肾组织中会出现细胞死亡，并严重影响肾脏功能。细胞凋亡是一种主要的细胞死亡类型，可因由多种途径介导的炎症和氧化应激反应所导致，极大地加剧了肾脏损伤和功能障碍[19,20]。本研究发现，与sham组相比，CLP组小鼠肾组织细胞凋亡率明显上升(P<0.05)；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织细胞凋亡率明显下降，这些观察结果表明黄芪甲苷在预防脓毒症诱导的急性肾损伤细胞凋亡中可能发挥了重要的保护作用。

SIRT1是一种NAD+(烟酰胺腺苷二核苷酸)依赖的脱乙酰化酶，因其在减轻氧化应激和炎症中的作用而被视为脓毒症诱导的急性肾损伤的主要调节分子之一[21]。SIRT1的作用主要依赖于其下游靶标的去乙酰化，如foxo1和NF-κB[22]。一方面，SIRT1对foxo1的去乙酰作用增加了抗氧化剂的合成，并提高了细胞抗氧化能力[23]。另一方面，SIRT1可以使NF-κB亚单位p65去乙酰化，以抑制炎性细胞因子的表达，并降低细胞炎症反应[24]。因此，SIRT1表达或活性的降低与氧化应激和炎症的增加密切相关。本研究观察到，与sham组相比，CLP组小鼠肾组织中SIRT1蛋白的表达及去乙酰化活性均显著降低，Bax、Caspase-3的表达增多；与CLP组相比，CLP+AS-Ⅳ组小鼠肾组织中SIRT1蛋白的表达及去乙酰化活性均显著增加，同时伴有凋亡相关指标Bax、Caspase-3的表达减少，这表明黄芪甲苷可能通过激活SIRT1及其相关的下游信号分子来介导其减轻脓毒症急性肾损伤的作用。

综上所述，在CLP诱导的脓毒症模型中，黄芪甲苷对脓毒症诱导的急性肾损伤具有有益的作用，这由脓毒症小鼠肾功能改善和肾组织学损伤减轻所证实。而黄芪甲苷发挥上述保护作用可能是通过激活SIRT1信号，进而抑制了脓毒症小鼠肾组织中的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡来实现的。