挖掘国家专利复方治疗肝癌的用药规律及分子机制*

姚元谦，吕建林，柳琳琳，王光耀，杨 坤

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，主要为肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinona，HCC），其病情发展迅速，死亡率高，5年生存率低于15%。我国属于肝癌高风险地区，主要与慢性乙型肝炎病毒感染及黄曲霉毒素暴露有关。2020年我国肝癌新发病例41万，死亡病例39万，占全球肝癌死亡病例的51%，是我国恶性肿瘤死亡的第二大诱因[1-2]。目前治疗肝癌的手段包括局部的手术、放疗、消融、介入治疗，以及全身性的化疗、细胞免疫、靶向药物治疗等[3]。手术治疗是早期肝癌的有效治疗手段，但大部分患者确诊时已是中晚期，故药物干预是治疗肝癌的重要手段。西医药物治疗不良反应较多，长期服用西药还可能产生耐药性，患者预后不佳[4-5]。

中医药医治肿瘤疗效确切，具有抑制肿瘤生长、提高患者生存质量、减轻临床症状等疗效。中西医联合治疗能够减少西药毒副作用、降低术后复发率、延缓病情进展，中医药防治肿瘤有着不可忽视的重要作用[6-7]。中医学强调对疾病的整体把握，现代医家通过辨证论治对肝癌进行治疗，效果明显，并总结出了许多专利复方。中医药专利复方均经过长期的临床应用，取得了肯定的临床疗效，具有较高的可重复性。本次研究整合数据挖掘、GEO基因芯片分析、网络药理学及分子对接技术，进一步系统分析国家专利复方治疗肝癌的用药规律，及其核心药物的潜在活性成分、作用靶点和调控途径，并进行分子模拟验证。

1 资料与方法

1.1 中药处方来源 登录国家知识产权公共服务网-专利检索及分析系统（https://www.cnipa.gov.cn/），以“肝癌and中药”为检索词，收集所有与肝癌相关的中药复方。纳入标准：（1）明确具有治疗肝癌作用的中药复方，且组方完整；（2）治疗方法为口服，剂型不限；（3）药味不限。排除标准：（1）治疗对象为动物的中药复方；（2）使用方法为外用的中药复方；（3）药物组成相同的中药复方只纳入一次。

1.2 数据规范处理 根据《中华人民共和国药典》对纳入的中药进行名称规范化处理，如“薏仁”规范为“薏苡仁”，“制军”规范为“大黄”。将所得的中药数据录入Excel建立“肝癌处方用药”数据库。为确保信息录入准确无误，由两名数据员交叉核对录入。

1.3 数据分析 将“肝癌处方用药”数据导入中医传承计算平台V3.0软件，选择“数据分析模块”下的“统计分析模块”及“方剂分析模块”，依次进行中药的四气、五味、归经、功效、频数、用药模式分析，并筛选出国家专利复方治疗肝癌的核心药对。

1.4 获取半枝莲-白花蛇舌草的活性成分及靶点 对“1.3”项下分析得出的核心药对进一步行生物信息学分析，检索TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、SymMap（www.symmap.org）数据库获取半枝莲-白花蛇舌草的活性成分，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为筛选条件进行收集。

通过TCMSP数据库下载各活性成分的mol2格式数据文件，依次上传至PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）预测各活性成分的潜在作用靶点，并以Norm Fit≥0.5为条件筛选出高概率靶点，然后将各靶点ID上传至UniProt平台（https://www.uniprot.org/）统一转换为GeneSymbol。

1.5 挖掘GEO芯片获取肝癌靶点 以“liver cancer”为关键词检索GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），筛选相关的基因芯片，获取GSE84402芯片数据集，下载该芯片的表达数据及GPL570基因芯片注释文件。该芯片数据包含肝癌组织样本14例、癌旁组织样本14例。

利用R软件对芯片数据进行分组，应用“lima”“pheatmap”程序包，以|logFC|≥1、P＜0.05为筛选条件，获取与肝癌相关的显著性差异基因，分别选取上调基因与下调基因中的前20个基因绘制热图。

1.6 筛选共同靶点并构建PPI核心网络 将“1.4”“1.5”项下的药物、疾病靶点导入R软件，应用“venn”程序包绘制药物-疾病靶点Venn图，并映射筛选出药物-疾病交集靶点。将交集靶点提交至STRING平台（https://string-db.org/）获取PPI蛋白互作网络，下载该网络数据的TSV格式文件并导入Cytoscape 3.7.2进行拓扑分析，通过连接度（Degree值）的中位数筛选出半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的核心靶点。

1.7 生物信息富集分析 将“1.6”项下的交集靶点导入R软件，应用“clusterProfiler”“DOSE”“org.Hs.eg.db”等程序包，进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）富集分析和基因本体论（gene ontology，GO）富集分析。

1.8 构建活性成分-靶点-通路网络 为了更清晰地展示半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的作用机制，运用Cytoscape 3.7.2软件绘制活性成分-基因靶点-作用通路网络图，并通过Degree值预测半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的主要活性成分。

1.9 分子对接验证 选取“1.8”项中主要活性成分的前5个作为小分子配体，选取与这5个活性成分连接度最高且是“1.6”项下的核心靶点作为蛋白受体。从TCMSP数据库下载主要活性成分的MOL2文件，从PDB数据库（https://www.rcsb.org）下载蛋白受体的pdb文件，使用PyMOL软件删除蛋白受体的水分子及配体，运用AutoDockTools1.5.6软件确定蛋白受体的活性口袋，最后通过AutoDock Vina软件进行分子对接。

2 结果

2.1 药物频数及药对分析 通过检索统计，共获得315首中药专利复方，549种药物，累计出现4 646次。统计显示，频数≥40的药物有21味。（见表1）设置支持度≥10%（约等于30次）、置信度≥90%进行核心组合筛选。结果显示，治疗肝癌的常用药对有半枝莲-白花蛇舌草、黄芪-白术、白术-茯苓等。（见表2）

表1 国家专利复方治疗肝癌的常用药物统计

表2 国家专利复方治疗肝癌的常用组合分析

2.2 药物性味归经及功效分析 四气主要为寒性（1 475次）、温性（1 203次）、平性（778次）；五味主要为苦味（2 168次）、甘味（1 670次）、辛味（1 355次）；主要归经为肝经（2 204次）、脾经（1 591次）、肺经（1 422次）、胃经（1 157次）、心经（1 052次）；药物功效以补虚、清热、活血化瘀为主。（见图1）

图1 国家专利复方治疗肝癌的药物功效分析

2.3 筛选半枝莲-白花蛇舌草及肝癌靶点 筛选获得33个药物活性成分，通过PharmMapper数据库得到396个药物靶点。对GSE84402芯片数据进行差异分析，共获得差异基因1 423个，其中在肝癌中表达上调的基因480个（如CCNB1、CDKN3、RACGAP1等），在肝癌中表达下调的基因943个（如FCN2、ABCA8、OIT3等）。分别选取上调基因与下调基因的前20个绘制热图，图中绿色为低表达，黑色为中表达，红色为高表达。（见图2）

图2 肝癌组织与正常组织差异基因热图

2.4 获取交集靶点并构建PPI核心网络 将药物-疾病靶点数据导入R软件，绘制Venn图（见图3），并映射筛选出交集靶点80个。构建交集靶点的蛋白互作网络，进行拓扑分析发现，该网络的核心靶点有ESR1（28）、AR（20）、TYMS（20）、CDK1（19）、CYP1A1（16）、MMP9（16）、CCNB1（16）、IGF1（15）等，提示这些靶点在半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌中发挥着关键作用（见图4）。图中节点越大、颜色越深表示连接度越高。

图3 药物-疾病靶点Venn 图

图4 交集靶点PPI 拓扑分析图

2.5 生物信息富集分析 应用R软件对80个交集靶点进行富集分析，得到生物过程（BP）条目716条，主要包括药物反应、酒精代谢过程、激素代谢过程、类固醇代谢过程等；得到细胞组分（CC）条目39条，主要在分泌颗粒腔、胞质囊泡腔、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等处发挥作用；得到分子功能（MF）条目68条，主要包括组蛋白激酶活性、类固醇结合、氧化还原酶活性等；得到信号通路31条，主要富集在化学致癌作用通路、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用通路、p53信号通路、花生四烯酸代谢等通路等信号通路。对主要条目进行绘图，见图5～6。

图5 半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌靶点GO 富集分析图

图6 半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌靶点KEGG 富集分析图

2.6 构建活性成分-靶点-通路网络 为了更加明确半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的活性成分、基因靶点与作用通路之间的关系，故构建网络图。（见图7）其中红色倒三角形节点为通路，蓝色圆形节点为靶点，黄色正方形节点为活性成分，节点越大说明连接度值越大。通过网络图可直观看出，半枝莲-白花蛇舌草对肝癌具有多途径、多成分的作用机制。根据Degree值，预测其治疗肝癌的主要活性成分见表3。

图7 半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的活性成分-靶点-通路网络图

表3 半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的主要活性成分

2.7 活性成分与靶点蛋白的分子对接 选取“2.6”项下的主要活性成分与“2.4”项下的核心靶点进行分子对接验证，运用AutoDock Vina软件进行对接并预测结合能力，结合能越低则构象越稳定，当结合能＜0 kcal/mol时表明配体与受体间有结合活性，当结合能＜-5.0 kcal/mol时表明结合良好[8]。结果显示，木犀草素-ESR1（-8.2 kcal/mol）、β-谷甾醇-TYMS（-7.5 kcal/mol）、豆甾醇-IGF1（-7.1 kcal/mol）、汉黄芩素-CYP1A1（-10.5 kcal/mol）、槲皮素-CDK1（-9.0 kcal/mol）与靶点蛋白分子间具有较强的结合活性。（见图8）

图8 各主要活性成分与核心靶点的分子对接图

3 讨论

肝癌可归属于中医学“积聚”“臌胀”“黄疸”等病证范畴，当代医家认为本病总属本虚标实，其病理因素与瘀毒、气滞、血瘀、痰凝等相关[9]。本研究通过挖掘国家专利数据库发现，当代医家治疗肝癌以补虚药（如黄芪、白术、当归）、清热药（如白花蛇舌草、半枝莲、茵陈）、活血化瘀药（如莪术、丹参、三七）等为主。《医宗必读》指出：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”，故治疗肝癌时应重视补益人体正气，并配之以治标，祛癌毒邪气、散气血积滞、消痰湿聚结。当代医家治疗肝癌时以固本培元、标本兼治为治疗法则。在性味方面，以寒温平、苦甘辛使用为主，寒性药可清热解毒，而温性药一方面能制约寒药攻邪太过，另一方面能起到温运痰湿、暖肝温脾的功效，苦味能泻能燥，能清泻湿热、化解瘀毒。甘味能补，补益人体正气、恢复脏腑功能。药物归经以肝经、脾经、肺经、胃经等为主。治肝的同时应重视对脾胃的顾护。肝、脾在生理活动中联系密切，若脾胃化源充足、气机升降相宜，则肝气条达、肝血充盈、疏泄正常，且肝木太过容易横犯脾土，正所谓“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”[10]。

国家专利复方治疗肝癌的核心药对为半枝莲-白花蛇舌草，两者均有一定的抗肿瘤活性。半枝莲具有广泛的抗肿瘤、抗氧化、抗炎等生物活性[11]。研究发现，半枝莲提取物能够逆转上皮-间充质转化，从而抑制肝癌细胞的迁袭[12]。白花蛇舌草同样有广泛的抗癌作用，能够促进肿瘤细胞凋亡、增强免疫功能[13]。但两者抗肿瘤的作用机制仍未完全明确，故本次研究通过生物信息学进一步分析半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的潜在机制。

半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的核心靶点有ESR1、AR、TYMS、CDK1、CYP1A1、MMP9、CCNB1、IGF1、PTGS2 等。ESR1（雌激素受体1）作为一种癌基因，是多种恶性肿瘤潜在的肿瘤抑制基因，在乳腺癌、非小细胞肺癌及宫颈癌中，ESR1的表达水平明显下调[14-15]。研究表明ESR1也是肝癌的肿瘤抑制基因，低ESR1表达会促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[16]，相反，ESR1的过度表达可以抑制肝癌细胞发展，同时诱导肝癌细胞的凋亡[17]。AR（雄激素受体）属于核受体超家族中的类固醇受体，实验发现肝癌中的巨噬细胞可能通过改变外泌体中的microRNA（miR-92a-2-5p）来降低肝癌细胞AR的表达，从而促进肝癌细胞的侵袭[18]。TYMS（胸苷酸合成酶）是临床中化疗药物的作用靶点，被认为是氟尿嘧啶类药物的主要作用部位[19]。研究发现，TYMS基因在肝癌中表达上调，可促进肝癌细胞DNA的合成，使肿瘤生长、扩散[20]。CDK1（周期蛋白依赖性激酶1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞周期调控中的重要因子。CDK1在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中表达上调，且与肝癌患者的预后相关，高表达的CDK1肝癌患者其预后较差[21]。CYP1A1（细胞色素P450 1A1酶）是细胞色素P450氧化酶家族成员之一，是体内重要的Ⅰ相代谢酶，在多种致癌物的活化和解毒过程中起着重要的作用[22]。研究发现，CYP1A1基因突变者更易发生肝癌，其危险性是CYP1A1基因未突变者的3.8倍[23]。基质金属蛋白酶9（MMP9）属于基质金属蛋白酶家族（MMPs）成员，参与正常生理过程中细胞外基质的分解。MMP9与肿瘤的发生及进展有关，当MMP9表达上调降解细胞外基质和基底膜，肿瘤细胞由此进入体循环形成新的肿瘤灶，同时MMP9能促进新血管的生成以维持肿瘤生长[24]。有研究[25]认为，MMP9与肝癌生长浸润及转移过程关系密切，可作为肿瘤分子标志物。CCNB1（细胞周期蛋白B1）与肿瘤关系密切，参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭等过程，在各种恶性肿瘤中呈过度表达[26]。实验表明，通过降低CCNB1表达能够抑制肝癌细胞的增殖及侵袭[27]。IGF1（胰岛素样生长因子1）参与肝脏的生理活动，影响肝细胞周期的进程、生长，且IGF1与各种肝脏疾病相关，在肝炎、肝硬化、脂肪肝及肝癌中表达下调。动物实验、体内外实验及流行病学调查均有证据表明IGF1对肝癌细胞具有调节作用[28]。PTGS2（前列腺素内过氧化物合成酶2）与炎症反应密切相关。研究[29]认为，炎症反应是促进肝癌发展的因素，抑制PTGS2/COX-2可以防止黄曲霉毒素驱动肝癌的发生及进展。

交集靶基因GO功能富集分析显示，半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌主要涉及药物反应、酒精代谢过程、类花生酸代谢过程、环氧酶P450途径、分泌颗粒腔、胞质囊泡腔、蛋白激酶活性。乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶是酒精代谢过程中的两个关键酶，这两种酶类分别由ADH、ALDH基因进行编码。研究认为酒精代谢可能与肝癌的进展有关。与正常组织相比，肝癌组织中ADH1和ALDH2基因的表达水平显著下降，且这两种基因低表达的患者其术后复发率高、生存时间短[30]，而上调ALDH2表达能够抑制肝癌细胞的增殖[31]。环氧酶P450生物途径能够将花生四烯酸代谢为具有生物活性的类花生酸，类花生酸是包括炎症在内的许多生物过程的关键调节剂，研究发现其能抑制肝脏炎症[32]。KEGG通路富集分析得到31条信号通路，主要富集在化学致癌作用通路、细胞色素P450对外源性物质的代谢通路、p53信号通路、FoxO信号通路、花生四烯酸代谢等通路，富集在通路上的基因出现较多的有PIK3R1、IGF1、CYP1A1、CYP1A2、ADH1C等。细胞色素P450传导通路负责药物、内源性物质及外源性物质的生物转化，此通路对肝癌细胞的生长起调控作用，并可影响化疗药物的疗效[33]，而CYP1A1、CYP1A2是该通路激活癌前物质的主要基因之一[34]。p53信号通路与肿瘤的发生关系密切，其重要节点p53基因通常在癌症患者中发生突变或失活，从而导致异常肿瘤细胞生长[35]。有研究证实，通过miR-29b调控p53信号通路能够抑制肝癌细胞增殖，并诱导肝癌细胞凋亡[36]。FoxO信号通路与转录有关，参与细胞周期控制、细胞凋亡、糖代谢等生理过程。研究表明FoxO因子是肿瘤抑制因子，低水平的FoxO与肝癌患者的不良预后相关，且可能增加对化疗药物的耐药性[37]。

半枝莲-白花蛇舌草治疗肝癌的主要活性成分可能为木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、汉黄芩素、槲皮素等。上述化合物均具有抗肿瘤作用，部分可增加抗肿瘤药物的敏感性。研究[38-42]表明，这些化合物在抗肝细胞癌方面具有多样的作用机制，能够抑制肝癌细胞的增殖、浸润、转移、侵袭，并能促进癌细胞凋亡。

本研究利用分子对接技术进行虚拟验证，对主要的活性成分与核心靶点进行对接分析，结果显示所有对接结合能均＜-5.0 kcal/mol，表明各主要活性成分与核心靶点间具有良好的结合力。

综上所述，在治疗肝癌的国家专利复方中，使用最多的药组为半枝莲-白花蛇舌草，表明其可能在治疗肝癌中发挥着重要作用。半枝莲-白花蛇舌草中的木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、汉黄芩素、槲皮素等活性成分，能上调ESR1、IGF1及下调PTGS2、MMP9、AR、TYMS、CDK1、CYP1A1、CCNB1 等核心 靶点，调控化学致癌作用通路、细胞色素P450代谢通路、p53信号通路、FoxO信号通路等，通过药物反应、酒精代谢过程、类花生酸代谢过程、环氧酶P450活性等生物功能，抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、扩散及对药物的耐药性。本次分析也从侧面反映了国家专利复方治疗肝癌的机制是多途径、多成分、多功能的，但此研究仍需进一步实验验证。