参黛清肠汤介导PI3K/Akt-mTOR通路抗溃疡性结肠炎相关癌变的作用研究*

杜明民，郎晓猛，崔建从，张晓利

（河北省中医院，河北 石家庄 050000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的消化系统慢性、非特异性、难治性疾病[1]。溃疡性结肠炎相关癌变（ulcerative colitis associated carcinogenesis，UCAC）属散发性结肠癌的一种，涉及多基因、多信号，是导致UC患者死亡的主要原因之一。临床研究发现，UC患者病程30年癌变的发生率高达18%[3]。目前，UCAC的治疗方法主要包括药物治疗、外科手术等方法，但治疗效果不太理想。中医药在整体观念、辨证论治的原则下针对病因病机、标本兼治以及随证加减的灵活用药，对UCAC治疗效果显著。参黛清肠汤以《寿世保元》中清肠汤为基础方，结合UCAC的中医证候辨证加减所得，可化湿浊，解瘀毒，具有化浊升清、解毒祛瘀之效[4-5]。目前关于此方对UCAC的作用及可能机制的研究少见报道。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylcholine-3 kinase，PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路参与了调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭。近年研究发现PI3K/AktmTOR通路与UCAC发生过程密切相关[6]。故本研究通过制备UCAC小鼠模型，探究参黛清肠汤对UCAC的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6健康雄性SPF级小鼠95只，6周龄，体质量18～22 g，购自河北医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（冀）2018-003。饲养条件：标准饲料，自由饮食和进水，环境温度21～27 ℃，相对湿度45%～55%，通风换气，气流速度10～25 cm/s，频率8～15次/h。本研究已经过医学实验动物管理委员会批准。

1.2 药物与试剂 参黛清肠汤组成：青黛20 g，白及20 g，黄柏15 g，儿茶15 g，黄连15 g，地榆12 g。以上中药经河北省中医院中药制剂室用蒸馏水煎煮并浓缩成药液，方药浓度为每1 mL原液含生药2 g。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）（批号：02160110-CF，纯度：99%）购自MP Biomedical公司；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）（批号：A5486）购自美国Sigma公司；水飞蓟宾（批号：20151106，纯度：99%）购自天津天士力集团有限公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号：191204）购自上海碧云天生物技术有限公司；脱氧核糖核酸断裂的原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色试剂盒（批号：11684817910）购自德国Roche公司；甲基噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（批号：M201910）购自美国Sigma公司；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）小提试剂盒（批号：12183025）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠磷脂酰肌醇3激酶（phosphatid ylinositide3-OH kinase，PI3K）一抗（批号：MA1-74183）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（phosphorylated serine/threonine kinase，p-Akt）一抗（批号：44-621G）、丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）一抗（批号：44-609G）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）一抗（批号：PA5-34663）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）一抗（批号：44-1125G）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2）一抗（批号：MA5-11757）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗（批号：PA5-11378）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（批号：PA1-16777）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗兔PI3K辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记二抗（批号：ab7090）、山羊抗兔p-Akt辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab97057）、山羊抗兔Akt辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab205718）、山羊抗兔p-mTOR辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab6721）、山羊抗兔mTOR辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab6702）、山羊抗兔Bcl-2辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab97080）、山羊抗兔Bax 辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab7085）、山羊抗GAPDH兔辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：ab97051）均购自英国Abcam公司；实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 主要仪器 E0987型组织包埋机、E0972型全自动石蜡切片机（上海碧云天生物技术有限公司）；BX53M型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；Optima离心机（美国Beckman公司）；Multiskan SkyHigh全波长酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；G05型PCR仪（上海力康生物医疗科技控股有限公司）；DYCZ-24DH型双板垂直电泳仪、DYCZ-40S型四板转印仪（北京六一生物科技有限公司）；TH-690型光密度扫描仪（北京海泰天恒科技有限公司）。

1.4 造模与分组 随机取85只小鼠采用DSS/AOM复合法制备UCAC小鼠模型，具体方法[7]：常规清洁水、饲料适应性饲养3 d后，次日给予小鼠10 mg/kg AOM腹腔注射1次，并用4%DSS溶液替换清洁水饮用1周，后2周饮用普通清洁水，3周为1个循环，造模持续3个循环共9周。剩余10只小鼠同步给予腹腔注射生理盐水，普通清洁水饮用作为空白组。UCAC模型小鼠出现消瘦、倦怠、活动量减少、腹泻、便血、腹部膨隆等症状且小鼠腹部超声结肠见癌结节，提示造模成功。共有51只小鼠造模成功，肿瘤发生率60%（51/85）。将UCAC小鼠按随机数字表法分为模型组（11只）、水飞蓟宾组（10只）、参黛清肠汤低剂量组（10只）、参黛清肠汤中剂量组（10只）、参黛清肠汤高剂量组（10只）。

1.5 实验给药 水飞蓟宾组小鼠给予水飞蓟宾（生理盐水溶解）灌胃，36 mg/kg；参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠给予参黛清肠汤（生理盐水溶解）灌胃，给药剂量分别为15、30、60 mg/kg，空白组、模型组小鼠给予生理盐水灌胃，各组小鼠灌胃体积均为1 mL/100 g，1次/d，连续4周。

1.6 观察指标

1.6.1 小鼠一般情况 每天观察小鼠饮水、进食、精神状态、体质量、毛发、大便、活动度等一般情况。

1.6.2 小鼠疾病活动指数（disease active index，DAI）变化 根据小鼠体质量变化与粪便性状进行评分。与造模成功后体质量比较，药物干预小鼠体质量下降≤1%，计0分；下降＞1%且≤5%，计1分；下降＞5%且≤10%，计2分；下降＞10%且≤15%，计3分；下降＞15%，计4分。小鼠粪便性状正常，计0分；软便但成型，计2分；软便不成型，计3分；腹泻，计4分。根据小鼠体质量下降率、粪便性状评分计算小鼠DAI。

1.6.3 HE染色观察小鼠结肠组织病理学变化 药物干预结束24 h后，颈椎脱臼法将小鼠处死，解剖并由回盲瓣至肛门分离其全部结肠，截取溃疡、肿瘤处病变肠段，若无溃疡及肿瘤则取红肿糜烂明显处肠段，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，脱蜡，组织切片（4 μm），常规苏木素、伊红染色，封片，显微镜下观察小鼠结肠组织病理学变化。

1.6.4 TUNEL法检测小鼠结肠组织细胞凋亡情况 取石蜡切片，严格按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书步骤进行操作。主要操作如下：切片脱蜡、水化，蛋白酶K工作液消化，磷酸盐缓冲液清洗，依次加末端转移酶（Terminal transferase，TdT）与荧光素标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP）混合反应液和封闭液，暗湿盒中反应，漂洗，加DAB底物，苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜下随机选取5个视野观察，记录阳性细胞数。

1.6.5 MTT法检测小鼠结肠癌细胞增殖情况 分离小鼠结肠癌组织块（空白组取相近部位组织块），去除血块、结缔组织及坏死组织，剪碎至糊状。200目尼龙细胞滤网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100pg/mL链霉素的改良Eagle培养基（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM）细胞培养液重悬细胞。细胞悬液转移至培养瓶，置于CO2培养箱中37 ℃培养过夜。细胞密度达80%后传代培养。

取对数期结肠癌细胞，以1×105个/mL的细胞密度接种于96孔板，每孔200 μL。待细胞贴壁后吸去培养基，加不含血清的DMEM培养液饥饿培养12 h后，换完全培养液继续培养24 h，每孔加5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h后终止培养，每孔加DMSO 150 μL，微振荡10 min。选择波长490 nm在酶标仪上检测各孔吸光度（A）值。实验重复3次，计算细胞增殖抑制率，肿瘤细胞增殖抑制率（%）＝1-（实验组A值/空白组A值）×100%。

1.6.6 RT-qPCR检测小鼠结肠组织PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达 取小鼠病变结肠组织，试剂盒提取结肠组织总RNA，严格按照说明书步骤操作，测RNA浓度、纯度，采用反转录试剂盒将RNA反转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），根据2×SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，双蒸水7 μL，配制PCR反应体系，上样（3个平行孔）进行荧光定量PCR反应，程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环40次，以内参基因β-actin Ct值计算目的基因相对表达量。采用DNAMAN软件设计引物，序列见表1。

表1 引物序列

1.6.7 Western blotting法检测小鼠结肠组织PI3K/Akt-mTOR通路相关分子及Bcl-2、Bax蛋白表达 提取小鼠病变结肠组织总蛋白，上样进行蛋白凝胶电泳，转膜，封闭，加PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗孵育，洗膜，加HRP标记二抗孵育，洗膜，加显影液于凝胶成像系统下曝光，光密度扫描仪检测目的蛋白光密度，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白光密度/GAPDH光密度。

1.7 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，多样本比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，两样本比较采用成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况及DAI评分变化 空白组小鼠饮水、进食量正常，反应敏捷，体质量随时间增加，毛发光泽，大便成型、规律，活动自如，无小鼠死亡。模型组小鼠饮水、进食量明显减少，精神萎靡、反应迟钝，体质量减轻，毛发粗糙无光泽，大便稀软出现脓血便，懒动。模型组中2只小鼠因严重便血死亡。与模型组比较，水飞蓟宾组和参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠饮水、进食量、精神状态、体质量、毛发光泽、大便及活动度等均不同程度改善。水飞蓟宾组灌胃时不慎死亡1只，参黛清肠汤低、中剂量组灌胃时各不慎死亡1只，参黛清肠汤高剂量组无小鼠死亡。

与空白组比较，模型组小鼠DAI评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾组和参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠DAI评分均明显降低（P＜0.05），且参黛清肠汤的作用呈剂量依赖性；参黛清肠汤中剂量组小鼠DAI评分与水飞蓟宾组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠DAI 评分比较（）

表2 各组小鼠DAI 评分比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟宾组比较，cP＜0.05；与参黛清肠汤低剂量组比较，dP＜0.05；与参黛清肠汤中剂量组比较，eP＜0.05

2.2 各组小鼠结肠组织病理学变化情况 空白组小鼠结肠黏膜组织结构完整，上皮细胞均匀饱满，未见炎症细胞浸润和病变；模型组小鼠结肠黏膜上皮脱落，腺体萎缩，溃疡大且数量多，上皮内瘤变，部分出现浸润癌；参黛清肠汤低剂量组小鼠结肠黏膜上皮结构部分破坏，结肠黏膜充血肿胀，出现低度不典型增生、淋巴滤泡及少量癌变；水飞蓟宾组和参黛清肠汤中剂量组小鼠结肠黏膜上皮结构较完整，溃疡数量较少，部分出现低度不典型增生、淋巴滤泡及癌变；参黛清肠汤高剂量组小鼠结肠黏膜上皮结构较完整，溃疡数量极少，部分出现低度不典型增生。（见图1）

2.3 各组小鼠结肠组织细胞凋亡情况 与空白组比较，模型组小鼠结肠组织细胞凋亡数量明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾组和参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠结肠组织细胞凋亡数量均明显增多（P＜0.05），且参黛清肠汤的作用呈剂量依赖性；参黛清肠汤中剂量组小鼠结肠组织细胞凋亡数量与水飞蓟宾组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3、图2）

表3 各组小鼠结肠组织细胞凋亡数量比较（）

表3 各组小鼠结肠组织细胞凋亡数量比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟宾组比较，cP＜0.05；与参黛清肠汤低剂量组比较，dP＜0.05；与参黛清肠汤中剂量组比较，eP＜0.05

2.4 各组小鼠结肠癌细胞增殖抑制率比较 与空白组比较，模型组小鼠结肠癌细胞增殖抑制率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾组和参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠结肠癌细胞增殖抑制率均明显升高（P＜0.05），且参黛清肠汤的作用呈剂量依赖性；参黛清肠汤中剂量组小鼠结肠癌细胞增殖抑制率与水飞蓟宾组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组小鼠结肠癌细胞增殖抑制率比较（）

表4 各组小鼠结肠癌细胞增殖抑制率比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与水飞蓟宾组比较，bP＜0.05；与参黛清肠汤低剂量组比较，cP＜0.05；与参黛清肠汤中剂量组比较，dP＜0.05

2.5 各组小鼠结肠组织PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相对表达量比较 与空白组比较，模型组小鼠结肠组织PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.05），Bax mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾组和参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠结肠组织PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显降低（P＜0.05），Bax mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05），且参黛清肠汤的作用呈剂量依赖性；参黛清肠汤中剂量组PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相对表达量与水飞蓟宾组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。6组小鼠结肠组织Akt mRNA、mTOR mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表5）

表5 各组小鼠结肠组织PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 相对表达量比较（）

表5 各组小鼠结肠组织PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 相对表达量比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟宾组比较，cP＜0.05；与参黛清肠汤低剂量组比较，dP＜0.05；与参黛清肠汤中剂量组比较，eP＜0.05

2.6 各组小鼠结肠组织PI3K/Akt-mTOR通路相关分子及Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 与空白组比较，模型组小鼠结肠组织PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），Bax蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾组和参黛清肠汤低、中、高剂量组小鼠结肠组织PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），Bax蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），且参黛清肠汤的作用呈剂量依赖性；参黛清肠汤中剂量组小鼠结肠组织PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量与水飞蓟宾组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。6组小鼠结肠组织Akt、mTOR蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见图3、表6）

表6 各组小鼠结肠组织PI3K/Akt-mTOR 通路相关分子及Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量比较（）

表6 各组小鼠结肠组织PI3K/Akt-mTOR 通路相关分子及Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与水飞蓟宾组比较，cP＜0.05；与参黛清肠汤低剂量组比较，dP＜0.05；与参黛清肠汤中剂量组比较，eP＜0.05

3 讨 论

UC是UCAC发病的独立危险因素之一[8]。UCAC发病机制复杂，目前尚未完全阐明。其发生过程涉及“炎症-非典型增生-癌变”；肠黏膜抗炎症细胞因子、促炎症细胞因子分泌异常，引起肠黏膜免疫系统失衡；炎性因子刺激介导肠黏膜发生持续、慢性炎症反应，损害肠道黏膜，导致“不典型增生”及“癌变”的发生。因此寻找高效、低毒的药物治疗UCAC具有重要的意义。

中医学认为UCAC归属“痢疾”范畴，病机为秽浊之气壅塞于肠，气血搏结日久，致脉络损伤，气滞血瘀，气血凝滞，腐败化脓，耗脾损肾。气、血、热、湿、瘀、毒雍滞于肠道，形成癌毒。本病以脾肾虚为本，气血热湿瘀毒为标[9]。参黛清肠汤中青黛具有清热解毒、凉血消斑、泻火定惊之功效，白及具有收敛止血、消肿生肌之功效，黄柏具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮之功效，儿茶具有活血止痛、收湿敛疮、止血生肌之功效，黄连具有泻火解毒、清热燥湿之功效，地榆具有解毒敛疮、凉血止血之功效。诸药共奏清热泄浊解毒之效，以治“痢疾”之根本。现代药理学研究表明，青黛提取物可促进结肠黏膜成纤维细胞增殖、胶原积累，促进结肠溃疡愈合，抑制肿瘤细胞恶性增殖，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[10-12]；白及提取物可抑制机体炎症水平，恢复机体免疫平衡，还可抑制癌细胞增殖，抑制裸鼠瘤质量，具有抗肿瘤活性[13-14]。

水飞蓟宾是一种多酚类黄酮素，具有抗氧化、肝脏保护等功效，对UC患者结肠黏膜炎症具有显著抑制作用。近年研究显示，水飞蓟宾可降低UCAC的发生率[15]。故本研究采用水飞蓟宾作为阳性对照药物。本研究采用“DSS+AOM”复合法制备UCAC小鼠模型，具有操作简便、周期短、成瘤率高、模拟性好等优点。造模期间，UCAC模型小鼠出现精神萎靡、大便稀溏、便血、体质量下降、毛发无光泽、蜷缩喜卧等症状；造模结束后小鼠肿瘤发生率约60%，与既往报道相符[16]。UCAC小鼠经水飞蓟宾和低、中、高剂量参黛清肠汤干预后，小鼠饮水、摄食、精神状态、毛发光泽、活动、大便等均不同程度改善，DAI评分降低，结肠黏膜组织病理损伤和癌变程度减轻。结果提示参黛清肠汤可以改善UCAC小鼠一般情况，减轻结肠黏膜组织损伤和癌变程度。

PI3K/Akt-mTOR信号通路是调控细胞生长、增殖、凋亡、自噬等生命活动的重要信号途径之一，可通过影响下游信号效应分子表达、活化状态发挥促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等关键作用。PI3K是磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）的重要激酶，可催化其产生磷酸肌醇三磷酸（PI3P），PI3P能与Akt结合并使其转位至细胞质膜；Akt被磷酸化激活后能通过直接、间接两种途径激活下游靶分子mTOR，经系列信号转导调控细胞生长[17]。Bcl-2是细胞凋亡抑制分子，Bax是细胞凋亡促进因子，两者均为Akt下游效应分子。因此PI3K/Akt-mTOR信号通路的激活、抑制可影响细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax等的表达[18]。DAI J H等[19]研究表明，AG1301可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。KIM J等[20]研究证实，艾蒿乙醇提取物可抑制PI3K/AKT/mTOR通路，诱导人肝癌细胞凋亡并抑制其生长、迁移和侵袭。本研究结果显示，UCAC小鼠经水飞蓟宾和低、中、高剂量参黛清肠汤干预后，结肠组织细胞凋亡数量明显增多，结肠癌细胞增殖抑制率明显升高，结肠组织PI3K、Bcl-2的mRNA和蛋白表达下调，p-Akt、p-mTOR蛋白表达下调，Bax的mRNA和蛋白表达上调。结果提示参黛清肠汤可抑制PI3K表达及AKt、mTOR磷酸化激活，抑制PI3K/Akt-mTOR信号转导，下调凋亡抑制因子Bcl-2表达，上调促凋亡因子Bax表达，从而促进UCAC小鼠结肠组织细胞凋亡，抑制癌细胞增殖。

综上所述，参黛清肠汤可改善UCAC小鼠一般情况，减轻结肠黏膜组织损伤和癌变，促进结肠组织细胞凋亡，抑制结肠癌细胞增殖，发挥抗UCAC的作用。其机制可能与抑制小鼠结肠组织PI3K、Bcl-2表达和Akt、mTOR活化，促进Bax表达，抑制PI3K/Akt-mTOR信号通路有关。