菟丝子总黄酮对PCOS大鼠血清甲状腺激素、排卵障碍的影响及机制研究*

赵千影，汪栋材，吴海滨，林基伟，宋晓容

（深圳市中医院，广东 深圳 518000）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是临床常见的内分泌紊乱疾病，多发于育龄期及青春期女性[1]。流行病学调查显示，我国PCOS发病率为5%～10%，且呈上升趋势。PCOS可在早期影响患者生殖及内分泌系统，造成其不孕，后期则易诱发高胰岛素血症、子宫内膜癌、糖尿病、心脑血管疾病等并发症[2]。口服避孕药是目前临床治疗PCOS的首选方法，可调节月经周期、增加排卵，以恢复生育能力，但对部分患者效果并不理想，且易加重胰岛素抵抗[3]。菟丝子总黄酮是中药菟丝子的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、提升免疫力、保肝、调节生殖系统功能等多种药理活性[4]。有研究[5]表明，菟丝子总黄酮可增加卵巢质量及卵泡数量、提高雌激素水平、提升卵巢功能，从而对卵巢早衰大鼠产生治疗作用，但关于其对PCOS甲状腺功能的影响及排卵障碍的治疗作用研究尚少，且缺乏对应的机制研究。本研究通过建立PCOS大鼠模型，观察菟丝子总黄酮对PCOS大鼠的治疗作用，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄雌性SPF级SD大鼠45只，体质量（170±10）g，健康状况良好，购自北京科宇动物养殖中心，生产许可证号：SCXK（京）2018-0010。饲养于清洁、通风环境，温度23 ℃左右，湿度60%左右，明暗周期12 h/12 h循环。本研究过程中处理动物时均符合2006年中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，并经本院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 菟丝子总黄酮（陕西昂威生物医药科技有限公司，批号：20090912）；丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）（北京华越洋生物科技有限公司，批号：62253-63-8）；脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）（上海沪震实业有限公司，批号：DKO124）；促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）放射免疫试剂盒（批号：E-EL-R0976c）、游离三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）放射免疫试剂盒（批号：E-EL-0079c）、游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）放射免疫试剂盒（批号：E-EL-0122c）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）放射免疫试剂盒（批号：SP12617）、甲状腺素（thyroxine，T4）放射免疫试剂盒（批号：SP12618）、促卵泡生长激素（follicle stimulating hormone，FSH）微粒子酶免疫试剂盒（批号：SP12603）、黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）微粒子酶免疫试剂盒（批号：SP12626）、雌二醇（estradiol，E2）微粒子酶免疫试剂盒（批号：SP12610）均购自武汉赛培生物科技有限公司；空腹胰岛素（fasting serum lisulin，FINS）放射免疫试剂盒（中国台湾Abnova公司，批号：KA3811）；兔抗大鼠p38 MAPK一抗（批号：ab221012）、兔抗大鼠p-p38 MAPK一抗（批号：ab284564）、兔抗大鼠ERK1/2一抗（批号：ab176640）、兔抗大鼠p-ERK1/2一抗（批号：ab126445）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 CX33显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；AIA-1800全自动荧光磁微粒酶免疫分析仪（日本东曹株式会社）；Gel SMART凝胶成像仪[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]。

1.4 造模与分组 35只大鼠建立PCOS模型。大鼠适应性饲养3 d后，颈背部皮下注射0.2 mL DHEA大豆油混合液（剂量：DHEA 60 mg/100 g体质量），1次/d，持续20 d，每日早上观察阴道涂片，若连续两个动情周期上皮细胞均未角化，则表明动情周期混乱，PCOS模型构建成功[6]。PCOS模型复制成功31只，采用随机数字表法分为PCOS组（11只）、干预组（10只）、联合组（10只）；另取10只正常大鼠注射0.2 mL大豆油，其余方法相同，设为对照组。

1.5 实验给药 确认建模成功次日，联合组大鼠灌胃菟丝子总黄酮生理盐水悬浊液（200 mg/kg）[7]，2 h后尾静脉注射EGF PBS溶液（10 μg/kg）[8]；干预组大鼠灌胃菟丝子总黄酮生理盐水悬浊液（200 mg/kg），2 h后尾静脉注射等量PBS；对照组、PCOS组大鼠灌胃等体积生理盐水，2 h后尾静脉注射等量PBS，1次/d，持续21 d。

1.6 观察指标 末次干预后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血，4 ℃下3 000 r/min离心10 min（离心半径8 cm），将获取血清分成两份，4 ℃冰箱保存，分别用于甲状腺激素检测及血糖指标检测；采血后颈椎脱臼处死大鼠，开腹取其双侧卵巢，切取部分卵巢组织，一半固定于4%多聚甲醛24 h，脱水、透明、浸蜡、包埋，切为4 μm连续病理切片，用于HE染色，另一半投入液氮中保存，用于蛋白检测。

1.6.1 血清甲状腺激素水平 取4 ℃保存血清，采用放射免疫分析法检测血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平，根据试剂盒说明书设计实验步骤，计算血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平。

1.6.2 血清性激素水平 取4 ℃保存血清，采用微粒子酶免疫分析法及全自动荧光磁微粒酶免疫分析仪检测FSH、LH、E2水平。

1.6.3 血清FINS、HOMA-IR 取4 ℃保存血清，经血糖仪检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、放射免疫试剂盒检测FINS，计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6.4 HE染色观察卵巢组织病理学改变及排卵情况 取卵巢组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，移入苏木精溶液浸泡8 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化液分化，自来水冲洗，促蓝液反蓝，移入伊红溶液染色2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，滴加中性树脂封片，光镜下观察卵巢组织病理变化，记录排卵数、囊样扩张卵泡数。排卵率=有排卵大鼠数/该组大鼠数×100%。平均排卵数=黄体总数/该组大鼠数×100%。囊性扩张卵泡率=囊样扩张卵泡总数/该组大鼠数×100%。

1.6.5 Western blotting法检测卵巢组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量 取液氮中保存的卵巢组织，剪碎并充分研磨，匀浆后加入RIPA液裂解细胞，移至离心管内，低温离心机9 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），经BCA试剂盒定量蛋白。取40 μg蛋白样本，以1∶4的体积比混合上样缓冲液，80 V电压下行凝胶电泳分离，湿法转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST清洗，混合工作浓度1∶500的兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗，加入二抗（1∶2 000）混匀，室温孵育40 min，ECL发光，暗盒显影，采用凝胶成像分析仪分析蛋白条带灰度值，p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量分别为p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值。计算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.7 统计学方法 通过SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料以（）表示，多样本资料比较用单因素方差分析，以LSD-t行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清甲状腺激素指标比较 与对照组比较，PCOS组大鼠血清TSH水平明显升高（P＜0.05），FT3、FT4、T3、T4水平均明显降低（P＜0.05）；与PCOS组比较，干预组大鼠血清TSH水平明显降低（P＜0.05），FT3、FT4、T3、T4水平均明显升高（P＜0.05）；与干预组比较，联合组大鼠血清TSH水平明显升高（P＜0.05），FT3、FT4、T3、T4水平均明显降低（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠血清甲状腺激素指标比较（）

表1 各组大鼠血清甲状腺激素指标比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与PCOS组比较，bP＜0.05；与干预组比较，cP＜0.05

2.2 各组大鼠血清性激素水平比较 与对照组比较，PCOS组大鼠血清LH水平明显升高（P＜0.05），FSH、E2水平均明显降低（P＜0.05）；与PCOS组比较，干预组大鼠血清LH水平明显降低（P＜0.05），FSH、E2水平均明显升高（P＜0.05）；与干预组比较，联合组大鼠血清LH水平明显升高（P＜0.05），FSH、E2水平均明显降低（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清性激素水平比较（）

表2 各组大鼠血清性激素水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与PCOS组比较，bP＜0.05；与干预组比较，cP＜0.05

2.3 各组大鼠胰岛素抵抗指标比较 与对照组比较，PCOS组大鼠FINS、HOMA-IR水平均明显升高（P＜0.05）；与PCOS组比较，干预组大鼠FINS、HOMA-IR水平均明显降低（P＜0.05）；与干预组比较，联合组大鼠FINS、HOMA-IR水平均明显升高（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠胰岛素抵抗指标比较（）

表3 各组大鼠胰岛素抵抗指标比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与PCOS组比较，bP＜0.05；与干预组比较，cP＜0.05

2.4 各组大鼠卵巢组织病理改变情况 对照组大鼠卵巢组织中可观察到处于不同发育阶段的卵泡，黄体数量较多，卵泡囊性扩张极少；PCOS组大鼠卵巢结构紊乱，可观察到较多卵泡囊性扩张，窦前卵泡、闭锁卵泡数量增加，发育期卵泡与黄体数量明显减少；与PCOS组比较，干预组、联合组大鼠卵巢结构有所改善，可观察到卵泡囊性扩张，以及一定数量的发育期卵泡及黄体，窦前卵泡、闭锁卵泡数量有所减少，其中干预组改善效果优于联合组。（见图1）

2.5 各组大鼠排卵情况比较 与对照组比较，PCOS组大鼠排卵率明显降低（P＜0.05），平均排卵数明显减少（P＜0.05），囊性扩张卵泡率明显升高（P＜0.05）；与PCOS组比较，干预组大鼠排卵率明显升高（P＜0.05），平均排卵数明显增加（P＜0.05），囊性扩张卵泡率明显降低（P＜0.05）；与干预组比较，联合组大鼠排卵率明显降低（P＜0.05），平均排卵数明显减少（P＜0.05），囊性扩张卵泡率升高（P＜0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠排卵情况比较（）

表4 各组大鼠排卵情况比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与PCOS组比较，bP＜0.05；与干预组比较，cP＜0.05

2.6 各组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比较 与对照组比较，PCOS组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明显升高（P＜0.05）；与PCOS组比较，干预组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明显降低（P＜0.05）；与干预组比较，联合组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明显升高（P＜0.05）。（见表5、图2）

表5 各组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比较（）

表5 各组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与PCOS组比较，bP＜0.05；与干预组比较，cP＜0.05

3 讨 论

PCOS是由下丘脑-垂体-卵巢轴代谢紊乱引起的非器质性疾病，临床表现为月经周期紊乱、排卵异常、胰岛素抵抗、高雄激素血症等，以双侧卵巢纤维化多囊性变，体积增大，膜下出现囊性扩张卵泡为主要病理改变[9]。肥胖、月经周期延长、缺乏运动、不良饮食习惯、母亲孕期健康不佳等均是PCOS的危险因素，目前其发病机制尚未被完全阐明，多认为与胰岛素抵抗、下丘脑内分泌失调、甲状腺功能异常、遗传及环境因素等相关，其中胰岛素抵抗机制被更多学者认可[10]。甲状腺激素可发挥胰岛素拮抗作用，其水平异常可影响促性腺激素活性，促使卵巢增大，加速PCOS发病，胰岛素抵抗加重可提升黄体生成素及雄激素水平，降低卵泡刺激素活性，从而减少排卵数量[11-12]。因此，寻找调节甲状腺激素同时降低胰岛素抵抗的新型治疗手段，对于PCOS治疗具有积极意义。

中医学将PCOS归于“月经不调”“闭经”“不孕”等范畴，认为“冲任起于胞宫，隶属肝肾”。本病主要病机为禀赋不足、后天失养、肾阳不足、肝气郁结、逆行犯脾，以致精血不足、血失流畅、任冲不通、天癸不至、胞宫虚寒、无血可下，子宫无法摄精成孕，终而发病。肾虚是其根本病因，故治疗应以补肾填精、活血化瘀为主[13]。中药菟丝子又称豆寄生，是临床常用补肾药材，取自双子叶寄生植物菟丝子干燥成熟种子，性平，味辛、甘，归肝经、肾经、脾经，可补肾、固精、止泻、明目。唐代名家甄权言其可治虚冷，填精益髓，去腰疼膝冷。现代中医著作《山东中药》记载，菟丝子可治妇人习惯性流产[14]。菟丝子总黄酮是菟丝子中黄酮类化合物的总称，作为一种植物雌激素，可在人体雌激素水平较低时表现类雌激素效应，在雌激素水平较高时表现抗雌激素效应，发挥其雌激素平衡作用[15]。有学者[16]认为，菟丝子总黄酮可修复子宫内双酚A诱导的小鼠后代卵巢功能障碍，提升促卵泡激素水平，促进排卵。本研究结果显示，与PCOS组比较，干预组大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平及囊性扩张卵泡率明显降低，FT3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平及排卵率明显升高，平均排卵数明显增加，提示菟丝子总黄酮可改善PCOS大鼠甲状腺激素及性激素水平，降低胰岛素抵抗，促进排卵。

MAPK/ERK通路是胞外至胞核信息传递的重要通路之一，广泛参与细胞增殖、迁移、分化等过程。p38 MAPK、ERK是该通路重要调节因子，均属于MAPK家族。细胞外刺激激活p38 MAPK后，磷酸化的p38 MAPK可进入细胞核，激活下游酶蛋白引发酶促反应，激活ERK1/2，p-ERK1/2激活下游相关基因转录，降低胰岛素受体底物活性，从而增加胰岛素抵抗[17-18]。YE H等[19]研究认为，抑制MAPK/ERK通路可改善PCOS大鼠卵巢形态，提升促卵泡激素水平，减轻胰岛素抵抗。本研究结果显示，与对照组比较，PCOS组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2均明显升高，干预组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38MAPK、-ERK1/2/ERK1/2均明显降低，且联合组大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平、囊性扩张卵泡率升高，FT3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平、排卵率均明显降低，平均排卵数减少，提示MAPK/ERK通路在PCOS中异常激活，菟丝子总黄酮可能通过调节该通路对PCOS产生治疗作用。

综上所述，菟丝子总黄酮可改善PCOS大鼠甲状腺激素及性激素水平，降低胰岛素抵抗，促进排卵。其作用机制可能与抑制MAPK/ERK通路有关。