miR-218靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路对甲状腺癌细胞的影响

王 钢，秦 鲜

(1.湖北省武汉市江夏区第一人民医院，湖北 武汉 430200 2.武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060)

甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)是一种常见的内分泌恶性肿瘤，病理学分型显示我国最常见类型为甲状腺滤泡状癌与甲状腺乳头状癌，分化良好的TC被认为是“惰性肿瘤”，患者的长期生存率可以高于95%[1]，而侵袭性TC具有近100%的疾病特异性死亡率[2]。20世纪80年代以后，许多国家TC的发病率继续上升，相关数据统计发现，1974年到2013年间的平均发病率约为6.66%，TC已经是发病率排名第九的癌症[3]。对TC发病机制及治疗方式的研究尤为紧迫，微小RNA-218(MicroRNA-218,miR-218)是肿瘤抑制性miRNA的一种，在宫颈癌组织中低表达可以显著促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭，其作用机制可能与miR-218靶向调控TPD52蛋白有关[4]。miR-218在结肠癌组织中可以调控磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路，抑制此通路的激活达到抑制结肠癌细胞侵袭和迁移的效果。相关研究发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路在TC组织中被激活，促进TC细胞的增殖，导致患者不良预后，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活可以有效诱导TC细胞凋亡与自噬，有利于改善患者TC病症[5]。因此本实验以TC细胞为研究对象，探究miR-218靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，期望为PTC患者带来新的曙光。

1 材料与方法

1.1细胞来源：人TC细胞株8505C(货号：GD-C00136260)购自上海冠导生物工程有限公司。

1.2主要试剂及仪器：LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(货号：L3000001)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；总RNA提取试剂盒(货号：R1200)购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA裂解液(货号：abs9229)购自爱必信(上海)生物科技有限公司；SD-001 MinuteTM总蛋白提取试剂盒(货号：SD-001)购自晨学生物科技(广州)有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒(货号：P0012S、C0039)购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM basic(1X)高糖培养液(货号：C11995500BT)购自广州赛国生物科技有限公司；ki-67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、PI3K、AKT、mTOR、GAPDH兔源抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(货号：A2094、A19080、A2095、A4860、AP0637、AP0115、A19742、A17909、A2445、A19056、AC005)均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；细胞培养箱(型号：WJ-80A-Ⅲ)购自上海海向仪器设备厂；酶标仪(型号XElx800)购自美国Perkin Elmer公司。

1.3细胞培养、分组与转染：将8505C细胞置于含有1%双抗与10% FBS的DMEM培养基中，使用24孔培养板于细胞培养箱中进行培养，培养气象条件为5% CO2，95%O2，温度设置为37℃。每两天更换培养基一次，当细胞密度高于80%时进行胰蛋白酶消化传代培养。将处于对数生长期的8505C细胞随机分为：对照组(未处理的8505C细胞)、miR-218 NC组(转染阴性mimics)、miR-218 mimics组(转染miR-218 mimics)、通路激活剂组(未处理的8505C细胞)滴加PI3K/AKT/mTOR通路激活剂IGF-1至终浓度100 ng/mL[6]、miR-218mimics+通路激活组(转染miR-218 mimics)滴加IGF-1至终浓度100 ng/mL。

1.4RT-QPCR法检测8505C细胞中miR-218表达水平：参照RNA提取试剂盒说明书的要求提取8505C细胞中总RNA，根据逆转录试剂盒中说明书的要求反转录得到cDNA。miR-218引物序列：上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；β-actin作为内参引物序列：上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTTGATCTAA-3'，下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。总反应体系为20μL：2×SYBR Mix10μL，H2O 8μL，上下游引物各0.5μL，10×cDNA模板1μL。反应条件设定为：95℃预变性30s，95℃变性30s、60℃退火延伸30s，共40个循环，72℃延伸50s。根据2-△△CT算法进行计算8505C细胞中miR-218的表达水平。

1.5CCK-8法检测8505C细胞增殖能力：取1.3各组8505C细胞，将浓度调整为2×105个/孔接种至24孔培养板中，每组设置3个复孔，培养气象条件为5% CO2，95%O2，温度设置为37℃，在药物处理的24h时后向每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2h，利用酶标仪检测450nm处的吸光度(OD)值。

1.6划痕实验检测8505C细胞迁移能力：取1.3各组8505C细胞，将浓度调整为2×105个/孔接种至24孔培养板中，将8505C细胞置于细胞培养箱(37℃、95%O2、5% CO2)中继续培养24h进行观察，待细胞铺满板内85%左右时，用10μL移液枪头垂直于24孔板底部做直线划痕，之后细胞继续置于恒温培养箱(37℃、95%O2、5% CO2)中培养后24h，于倒置光学显微镜下拍照(×100)观察，利用Image J软件测量划痕区域面积，并计算细胞划痕愈合率=1-24h划痕面积/0h划痕面积×100%。实验进行3次重复。

1.7Transwell实验检测8505C细胞侵袭能力：对于8505C细胞侵袭能力测定步骤如下，将4×105个8505C细胞悬浮在200μL无糖与FBS的DMEM培养基中，将8505C细胞悬浮液加入到预先涂有Matrigel的Transwell上室中，同时向Transwell下室中加入600μL含10%FBS的DMEM培养基，常温下孵育48h后，用棉签擦除上室表面的细胞，将侵袭的细胞用4%的多聚甲醛固定15min，1%结晶紫染色20min，随机选取3个视野利用显微镜观察并计数，估算8505C细胞的侵袭能力。

1.8Western blot检测8505C细胞中蛋白表达水平：取1.3各组8505C细胞浓度调整为2×105个/孔接种至24孔培养板中，使用RIPA裂解缓冲液中裂解30min，在4℃条件下以10000rpm离心10min，收集上清即获得各组8505C细胞总蛋白。通过BCA试剂盒测定蛋白质浓度，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)方法将各组8505C细胞总蛋白分离出等量的蛋白质，使用湿转法将分离出的各组等量蛋白质转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1h后，加入一抗ki-67(1∶1000)、MMP-2(1∶2500)、MMP-9(1∶2000)、p-PI3K(1∶3000)、PI3K(1∶1000)、p-AKT(1∶3000)、AKT(1∶2000)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶2500)、GAPDH(1∶1000)在4℃条件下孵育过夜，第2天再加入羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室温下孵育2h。显影并通过Image J软件对目标条带的灰度值进行分析，获得各组8505C细胞总ki-67、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。

2 结 果

2.1各组8505C细胞中miR-218表达水平：与对照组比较，miR-218 NC组8505C细胞中miR-218 mRNA表达水平变化不显著(P>0.05)，miR-218 mimics组8505C细胞中miR-218 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)，通路激活剂组8505C细胞中miR-218 mRNA表达水平显著下调(P<0.05)；与miR-218 mimics组相比，miR-218 mimics+通路激活组8505C细胞中miR-218 mRNA表达水平显著下调(P<0.05)，见表1。

表1 各组8505C细胞中miR-218 mRNA表达水平

2.2各组8505C细胞增殖情况：与对照组比较，miR-218 NC组8505C细胞在24h时的OD450值变化不显著(P>0.05)，miR-218 mimics组8505C细胞在24h时的OD450值显著下调(P<0.05)，通路激活剂组8505C细胞在24h时的OD450值显著上调(P<0.05)；与miR-218 mimics组相比，miR-218 mimics+通路激活组8505C细胞在24h时的OD450值显著上调(P<0.05)，见表2。

表2 各组8505C细胞增殖情况

2.3各组8505C细胞迁移情况：与对照组比较，miR-218 NC组8505C细胞划痕愈合率变化不显著(P>0.05)，miR-218 mimics组8505C细胞划痕愈合率显著下调(P<0.05)，通路激活剂组8505C细胞划痕愈合率显著上调(P<0.05)；与miR-218 mimics组相比，miR-218 mimics+通路激活组8505C细胞划痕愈合率显著上调(P<0.05)，见表3，图1。

表3 各组8505C细胞迁移情况

图1 划痕愈合实验检测各组8505C细胞迁移能力(×200)

2.4各组8505C细胞侵袭情况：与对照组比较，miR-218 NC组8505C细胞侵袭数目变化不显著(P>0.05)，miR-218 mimics组8505C细胞侵袭数目显著下调(P<0.05)，通路激活剂组8505C细胞侵袭数目显著上调(P<0.05)；与miR-218 mimics组相比，miR-218 mimics+通路激活组8505C细胞侵袭数目显著上调(P<0.05)，见图2、表4。

图2 Transwell检测各组8505C细胞侵袭能力(×200)

表4 各组8505C细胞侵袭数目比较

2.5各组8505C细胞中增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达情况：与对照组比较，miR-218 NC组8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平变化不显著(P>0.05)，miR-218 mimics组8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，通路激活剂组8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著上调(P<0.05)；与miR-218 mimics组相比，miR-218 mimics+通路激活组8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著上调(P<0.05)，见图3，图4。

图3 Western Blot检测各组8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达情况

2.6各组8505C细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达情况：与对照组比较，miR-218 NC组8505C细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平变化不显著(P>0.05)，miR-218 mimics组8505C细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，通路激活剂组8505C细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著上调(P<0.05)；与miR-218 mimics组相比，miR-218 mimics+通路激活组8505C细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著上调(P<0.05)，见图5和表5。

表5 各组8505C细胞中p-PI3K p-AKT p-mTOR蛋白表达情况

图4 各组8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达情况

图5 Western Blot检测各组8505C细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白

3 讨 论

TC是一种具有侵袭性的癌症，手术、放射性碘及甲状腺激素抑制剂等治疗方式，有治愈TC的可能，但是患者出现淋巴结转移等病理特征时，TC患者具有较差的预后，同时TC癌细胞显示出有丝分裂增加的特征[7]。miRNA参与细胞分化、细胞增殖、信号转导等多种途径，具有成为治疗靶点和生物标志物的潜力，通过对文献检索发现miRNA在TC细胞增殖、迁移与侵袭过程中发挥重要调控作用[8]。miR-218在肾细胞癌、前列腺癌、宫颈癌等多种肿瘤组织和细胞中低表达，发挥抑制细胞增殖及转移的作用。当miR-218在口腔癌细胞UM1中过表达时可以逆转口腔癌细胞UM1的耐药性，促进其凋亡[9]。既往研究发现，miR-218在TC组织和细胞系中下调表达，且能够抑制细胞迁移、侵袭和肿瘤生长[10]。但是，miR-218抑制TC细胞生物学行为的分子机制尚不清楚。因此本实验以人TC细胞株8505C为研究对象，通过转染miR-218 mimics发现，miR-218表达水平显著上调，增殖能力、细胞划痕愈合率、侵袭数目显著降低，与之前的研究一致，说明上调8505C细胞中miR-218表达水平可以显著抑制8505C细胞的增殖、迁移以及侵袭。ki-67是公认的评估细胞增殖活性的标志物之一，其过表达是TC复发的独立危险因素[11]。MMP-2与MMP-9在TC患者体内的含量对于肿瘤的迁移与侵袭具有重要意义，其在TC患者体内水平显著升高，意味着不良预后[12]。本实验通过检测不同处理的8505C细胞中的蛋白水平发现，转染miR-218 mimics后，8505C细胞中ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著下调，其结果表明，上调8505C细胞中miR-218表达水平对8505C细胞的增殖、迁移以及侵袭的抑制作用与降低ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达密切相关。

PI3K/Akt/mTOR信号通路的信号转导对细胞的增殖、代谢与凋亡具有重要调控作用，在癌症患者中此信号通路失调，其与癌症的发生与发展具有密切关系。PI3K/Akt/mTOR信号通路异常激活会导致TC患者具有较差的预后[13]。使用白藜芦醇可以抑制TC细胞增殖、迁移与侵袭，可能与其显著抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活有关。本实验发现，过表达miR-218能够降低8505C细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平，这与上述研究结果一致，说明在8505C细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路处于激活状态，可能导致肿瘤的进一步恶化，而上调8505C细胞中miR-218的表达可使原本的活化状态被抑制，从而抑制细胞的增殖、迁移及侵袭，减缓肿瘤的进展过程。进一步使用PI3K/Akt/mTOR信号通路激活剂处理8505C细胞发现，通路激活剂组8505C细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著高于对照组，表明通路激活剂可以激活PI3K/Akt/mTOR信号通路；而且在转染miR-218 mimics的基础上加入通路激活剂后，miR-218对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制作用被消除，同时，8505C细胞的增殖能力、细胞划痕愈合率、侵袭数目及ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著上调，提示miR-218抑制8505C细胞增殖、迁移与侵袭的作用，可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活进而抑制ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。

综上所述，miR-218通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活抑制8505C细胞增殖、迁移与侵袭。PI3K/Akt/mTOR信号通路纷繁复杂，还有待进一步确认其它信号通路在此过程的调控作用，更需要临床中检验miR-218在TC发生与发展中的作用。