咪达唑仑调控miR-875-5p/STAG2轴对食管癌细胞增殖及凋亡的影响

刘梦诗，崔光锐，邱 坚，廖微微

(海南医学院第二附属医院消化内镜科，海南 海口 570100)

食管癌是最常见的胃肠道肿瘤之一，近年来发病率呈逐步上升趋势[1]。由于患者在早期可能出现消瘦、恶心、体重减轻等非特异性症状，使食管癌的早期诊断变得困难。近年来，尽管通过手术、化疗或放疗等方式对食管癌的治疗已经取得了很大进展，但对于这种致命的疾病仍然没有有效的根治方法，存活率仍然很低[2]。因此，探究食管癌的发病机制，寻找治疗食管癌的药物，对于提高食管癌患者的生存率具有重要的意义。有研究表明，麻醉药物能够影响肿瘤细胞的生长与转移[3]，而咪达唑仑(midazolam，MID)作为一种外科手术常用的的麻醉药物，可诱导肺癌A549细胞凋亡[4]，但MID对于食管癌细胞增殖、凋亡的影响尚不清楚。另有研究表明，miR-875-5p在食管癌细胞中呈高表达，且促进食管癌细胞的增殖和转移[5]。本研究通过生物信息学预测发现miR-875-5p与基质抗原2(Stromal antigen 2，STAG2)存在结合位点，STAG2是位于X染色体(Xq25)上，含有34个外显子的基因，已有研究报道上调STAG2基因的表达能抑制肾癌细胞的增殖能力、促进肾癌细胞的凋亡[6]。但MID是否可通过影响miR-875-5p/STAG2轴来调控食管癌细胞的增殖与凋亡尚未可知。因此。本研究主要探讨MID对食管癌细胞增殖、凋亡的影响，分析其是否能够调控miR-875-5p/STAG2轴，旨在为食管癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器:人食管癌细胞系Eca109及食管正常上皮细胞HEEC均购自深圳市豪地华拓生物公司；miR-875-5p模拟物(miR-875-5p mimics)及其阴性对照(miR-NC)、miR-875-5p抑制物(anti-miR-875-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)均购自美国ThermoFisher公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)均购自TaKaRa公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒均购自金图生物公司；蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂盒均购自美国Bio-Rad公司；细胞周期试剂盒、TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒、TransStart®Green qPCR SuperMix均购自上海李记生物公司；STAG2兔多克隆抗体、β-actin兔多克隆抗体(anti-STAG2、anti-β-actin)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗均购自美国Abcam公司；荧光定量PCR仪、CO2培养箱均购自德国SIGMA公司。

1.2细胞培养及分组:将Eca109细胞及食管正常上皮细胞HEEC在37℃，含有5%CO2的培养箱中进行培养。收集对数生长期的Eca109细胞接种到6孔培养板中(3×104个/孔)，参照文献[7]，用不同浓度的MID(0，10，20，30，40μmoL/L)处理Eca109细胞24h，通过CCK-8法检测Eca109细胞的存活率，筛选适宜的MID浓度用于后续实验研究。细胞分组：在Eca109细胞中加入MID并调整浓度为30μmoL/L，记为MID组；正常培养的Eca109细胞记为NC组。细胞融合率达到80%左右时，利用LipofectamineTM2000转染试剂盒对Eca109细胞进行分组转染，分组如下：anti-miR-NC组(细胞转染anti-miR-NC)、anti-miR-845-5p组(细胞转染anti-miR-845-5p)、MID+miR-NC组(细胞转染miR-NC后使用含有30μmoL/L MID的RPMI 1640培养基培养24h)、MID+miR-875-5p mimics组(细胞转染miR-875-5p mimics后使用含有30 μmoL/L MID的RPMI 1640培养基培养24h)。

1.3miRNA转录组测序:提取MID组及NC组Eca109细胞的总RNA，对总RNA进行质量检测及处理后构建cDNA文库，通过RNA-seq测序及生物信息学技术分析MID组及NC组差异表达的miRNA。

1.4CCK-8法检测Eca109细胞存活率:分别收集Eca109细胞接种至96孔板(5×103个/孔)中，按照1.2中的方法进行相应处理后，在37℃、5%CO2的条件下培养48h。然后再向每个孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育3h，采用全自动酶标仪测定Eca109细胞在450nm波长处的吸光值(OD值)。细胞存活率(%)=(OD实验-OD空白对照)/(OD正常对照-OD空白对照)×100%。

1.5流式细胞术检测Eca109细胞凋亡情况:分别收集不同处理组的Eca109细胞并用冰冷的PBS洗3次，加入200μL Annexin V-FITC结合液,轻轻重悬细胞，室温(20-25℃)避光孵育15min；1000rpm离心5min，除去上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞；加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，冰溶避光放置2h；进行流式细胞仪检测；最后使用FlowJo V10软件对数据进行分析。

1.6流式细胞术检测Eca109细胞周期:将细胞用75%乙醇过夜固定后，按照细胞周期试剂盒说明书处理细胞，最后利用流式细胞仪检测细胞周期。

1.7qRT-PCR检测Eca109细胞中miR-875-5p、STAG2 mRNA表达水平:用Trizol试剂从Eca109细胞中提取总RNA，利用TaqMan逆转录试剂盒将1μg RNA逆转录成cDNA，使用TransStart®Green qPCR SuperMix试剂盒对miR-875-5p、STAG2 mRNA表达水平进行定量。以GAPDH为内参，标准化STAG2值；以U6为内参，标准化miR-875-5p值。最后通过2-△△CT法计算基因表达水平。所用引物序列见表1。

表1 miR-875-5p U6 STAG2 GAPDH qRT-PCR引物序列

1.8Western Blot检测Eca109细胞中STAG2蛋白表达水平:用RIPA裂解缓冲液提取Eca109细胞蛋白，将20μg蛋白质样品经电泳、转膜后，用5%脱脂牛奶封闭1h，分别添加兔多克隆抗体anti-STAG2(1∶4000)、anti-β-actin(1∶3000)于4℃下孵育过夜，然后与二抗(1∶5000)在TBST中室温孵育2h。加入ECL试剂观察蛋白质印迹。对蛋白质条带进行扫描，并对灰度值进行量化分析。

1.9双荧光素酶报告基因实验验证miR-875-5p与STAG2靶向关系:使用starbase网站预测miR-875-5p与STAG2的结合位点。分别构建STAG2的野生型(WT)和突变型(MUT)3'-UTR区质粒，标记为WT-STAG2、MUT-STAG2。将WT-STAG2和MUT-STAG2分别与miR-NC或miR-875-5p mimics共转染Eca109细胞，48h后，用细胞裂解液裂解细胞15 min，离心，收集细胞上清；打开GLO-MAX 20/20荧光检测仪，设置程序，读数10 s，检测间隔2 s；将20μL的上清液、100 μL萤火虫荧光素酶底物LARII加入到96孔板中混匀后开始检测，记录数据；反应结束后，每孔加入100μL海肾荧光素酶工作液，混合均匀，终止萤火虫荧光素酶反应，启动海肾荧光素酶反应，开始检测并记录数据。计算二者比值，分析结果。

1.10体内异种移植瘤实验:20只雄性BALB/c裸鼠随机分为裸鼠NC组、裸鼠MID组、裸鼠MID+miR-NC组、裸鼠MID+miR-875-5p mimics组，每组5只，将细胞浓度为4×106个/mL的200μL对应的细胞悬液分别注射到裸鼠右腋下，NC组注射等量的细胞培养液，标准条件下饲养15d后颈椎脱臼处死各组裸鼠，分离出肿瘤并测量肿瘤质量。

2 结 果

2.1MID对Eca109细胞增殖的影响:与0μmoL/L MID相比，10μmoL/L MID、20μmoL/L MID、30μmoL/L MID、40μmoL/L MID处理的Eca109细胞存活率显著下降(P<0.05)，见图1，且MID浓度为30μmoL/L时，细胞存活率接近50%，因此后续选用30μmoL/L MID用于研究。

图1 不同浓度MID对Eca109细胞增殖的影响

2.2miRNA转录组测序筛选差异miRNA:通过高通量测序和统计学分析后结果见图2，▲为显著上调的miRNA，▼为显著下调的miRNA，●表示无显著性差异的miRNA，本研究发现在显著下调的miRNA中有miR-875-5p，表明MID可抑制Eca109细胞中miR-875-5p的表达。

图2 MID处理后的Eca109细胞的miRNA转录组测序分析

2.3MID对Eca109细胞增殖、凋亡、细胞周期及miR-875-5p表达的影响:MID组Eca109细胞存活率、S期细胞比例、miR-875-5p表达水平显著低于NC组，细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著高于NC组(P<0.001)，见图3。

图3 MID对Eca109细胞增殖、凋亡、细胞周期及miR-875-5p表达的影响

2.4Eca109细胞和HEEC细胞中miR-875-5p与STAG2 mRNA表达:与食管正常上皮细胞HEEC比较，食管癌Eca109细胞中miR-875-5p表达水平显著升高，而STAG2 mRNA表达水平显著降低(P<0.001)。见图4。

图4 Eca109细胞中miR-875-5p与STAG2的表达水平

2.5miR-875-5p靶向调控STAG2的表达:使用starbase网站预测发现miR-875-5p与STAG2存在结合位点，见图5A。与miR-NC+WT-STAG2组比较，miR-875-5p mimics+WT-STAG2组Eca109细胞的荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)，而miR-875-5p mimics+MUT-STAG2组Eca109细胞的荧光素酶相对活性与miR-NC+MUT-STAG2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图5B。

图5 miR-875-5p靶向调控STAG2的表达

2.6抑制miR-875-5p表达对Eca109细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响:anti-miR-875-5p组Eca109细胞中miR-875-5p表达水平显著低于NC组和anti-miR-NC组，提示细胞转染成功，见图6A。与NC组和anti-miR-NC组比较，anti-miR-875-5p 组Eca109细胞的存活率、S期细胞比例显著降低，而细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05)，见图6。

图6 抑制miR-875-5p表达对Eca109细胞中miR-875-5p表达水平、细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

2.7过表达miR-875-5p可逆转MID对Eca109细胞增殖、凋亡及细胞周期的作用:与NC组比较，MID干预后的Eca109细胞中miR-875-5p表达水平、细胞存活率、S期细胞比例显著降低，细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05)；将miR-875-5p mimics转染至Eca109细胞并联合MID干预后，Eca109细胞中miR-875-5p表达水平、细胞存活率、S期细胞比例显著高于MID组和MID+miR-NC组，细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著低于MID组和MID+miR-NC组(P<0.05)，见图7。

图7 过表达miR-875-5p可逆转MID对Eca109细胞增殖、凋亡及细胞周期的作用

2.8过表达miR-875-5p对MID处理的Eca109细胞中STAG2表达的影响:MID组Eca109细胞中STAG2 mRNA及蛋白表达水平显著高于NC组(P<0.05)，而与MID组和MID+miR-NC组相比，MID+miR-875-5p mimics组Eca109细胞中STAG2的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见图8。

图8 过表达miR-875-5p对MID处理的Eca109细胞中STAG2 mRNA及蛋白表达的影响

2.9MID及miR-875-5p对裸鼠体内移植瘤生长的影响:与裸鼠NC组比较，裸鼠MID组裸鼠体内移植瘤质量显著降低(P<0.05)；与裸鼠MID组、裸鼠MID+miR-NC组比较，裸鼠MID+miR-875-5p mimics组裸鼠体内移植瘤质量显著升高(P<0.05)，见图9。

图9 MID及miR-875-5p对裸鼠体内移植瘤生长的影响

3 讨 论

MID是一种苯二氮卓类化合物，其具有典型的苯二氮卓类药理活性，可产生抗焦虑、镇静、催眠、抗惊厥及肌肉松弛作用[7]。近年来，MID在抗肿瘤的研究中备受关注。如邓大立等[8]阐明MID可通过上调miR-137表达，抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡；Sun等[9]阐述MID能抑制非小细胞肺癌细胞增殖。本研究发现，不同浓度的MID(0，10，20，30，40μmoL/L)干预Eca109细胞后，随着MID浓度的升高，Eca109细胞存活率显著下降，且MID浓度为30μmoL/L时，细胞存活率接近50%，因此选用30μmoL/L MID用于后续研究；另外，本研究还发现经30μmoL/L MID干预的Eca109细胞增殖能力、S期细胞比例降低，细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例增加，这与报道[7，9]是一致的，提示MID可能通过抑制Eca109细胞增殖，促进细胞凋亡，并将细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞分裂的方式来发挥抗肿瘤作用。

miRNA是一种由22个左右的核苷酸组成的非编码的小分子单链RNA，其与mRNA的3‘端非编码区以完全或不完全互补的方式相互作用，促进mRNA降解，进而抑制mRNA翻译。miRNA对多种基因具有调控作用，在细胞增殖、凋亡、细胞周期等细胞生物学行为中发挥重要作用。一些miRNAs具有抑癌基因的功能，可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。另一些miRNAs具有原癌基因的功能，能抑制抑癌基因的表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。miR-875-5p作为一种与肿瘤的发生发展密切相关的miRNA，已有研究报道，miR-875-5p通过抑制SATB2促进肺癌细胞的侵袭[10]；miR-875-5p在甲状腺癌中高表达，其上调可诱导甲状腺癌细胞增殖[11]。表明miR-875-5p在多种肿瘤中具有致癌的作用。本研究通过采用高通量miRNA转录组学分析筛选出miR-875-5p在MID处理的Eca109细胞中显著下调，同时通过qRT-PCR验证了MID干预可抑制Eca109细胞中miR-875-5p表达，证明MID确实可引起miR-875-5p的下调。本研究结果同样证实了miR-875-5p具有促癌作用，本研究发现miR-875-5p在Eca109细胞中高表达；抑制miR-875-5p表达可显著抑制Eca109细胞增殖、促进细胞凋亡、G0/G1期细胞比例增加；过表达miR-875-5p可逆转MID对Eca109细胞增殖、凋亡及细胞周期的作用，同时还可逆转MID对裸鼠体内移植瘤生长的抑制作用。提示MID通过下调miR-875-5p抑制Eca109细胞增殖，促进细胞凋亡，调控细胞周期。

为了进一步探究MID通过下调miR-875-5p抑制Eca109细胞增殖，促进细胞凋亡，调控细胞周期的具体机制，本研究通过starbase网站预测和双荧光素酶实验证实STAG2是miR-875-5p的靶基因。STAG2是黏着蛋白复合物的亚基成分之一，其在有丝分裂或减数分裂过程中姐妹染色单体的正常分离中起着重要的作用。据报道，STAG2 突变可以改变染色质结构和转录程序，从而促进侵袭性癌症表型[12]；STAG2在宫颈癌组织中呈低表达状态，过表达STAG2可抑制宫颈癌细胞迁移及侵袭[13]。本研究结果与上述研究是一致的，本研究结果表明，STAG2在Eca109细胞中低表达；MID能够上调Eca109细胞中STAG2 mRNA及蛋白表达水平；过表达miR-875-5p则逆转MID处理对Eca109细胞中STAG2表达的促进作用。表明miR-875-5p通过靶向STAG2，可能是MID调控Eca109细胞增殖、凋亡以及细胞周期的重要途径。

综上所述，在Eca109细胞中miR-875-5p高表达，STAG2低表达，MID通过下调miR-875-5p水平靶向促进STAG2的表达，从而抑制Eca109细胞增殖，促进细胞凋亡。该研究为MID对食管癌的作用机制奠定理论基础，为食管癌的治疗提供新的方向。但是MID对食管癌细胞增殖和凋亡的作用涉及的分子机制较多，有待后续进一步深入探究。