基于数据挖掘和网络药理学探讨中药外治治疗乳腺癌相关淋巴水肿的用药规律及机制*

陈筱筱，吴雪卿，邵士珺，瞿文超，陈玮黎，万 华

（1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200120；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200080）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，根据世界卫生组织国际癌症研究机构的统计数据显示，2020年乳腺癌发病人数首次超过肺癌，成为全球最常见癌症。而在乳腺癌治疗过程中，约20%的患者都会出现淋巴水肿，常见的主观临床症状是肿胀、麻木、沉重、紧绷、僵硬、协调性和活动度降低、肢体疲劳或虚弱，影响患者正常肢体运动，日常功能受损，从而大大降低生活质量并且影响患者的身心健康[1-2]。此外，淋巴水肿的程度不一，国际淋巴学会将其分为3个阶段[3]。关于乳腺癌相关淋巴水肿（breast cancer-related lymphedema，BCRL）的病因，现在国内外研究者多认为与淋巴管堵塞及间质蛋白积聚、间质功能失调相关。目前治疗方式主要包括引流、压迫、功能运动及手术治疗，但是在选择最佳的治疗方式上仍存在挑战[4]，综合减充血疗法仍然是目前公认的一线治疗，但是疗效很大程度取决于患者的依从性[5]。

研究[6-8]显示中药外治在BCRL中疗效佳，单独应用抑或联合中药外治均能达到提高疗效的作用，但因为中医各家学术思想的差异，中药外治方多样且复杂，缺乏相应的机制研究。因此，本研究从乳腺癌相关淋巴水肿出发，通过数据挖掘等相关手段，挖掘文献中既往报道有效的中药外治方，并对筛选出的核心药物进行可能机制的分析及分子靶点研究。

1 资料与方法

1.1 检索方法以“中医外治”“中药外治”“中药外敷”“中药敷贴”“中药贴敷”“乳腺癌淋巴水肿”“乳腺癌上肢水肿”“乳腺恶性肿瘤淋巴水肿”“乳腺恶性肿瘤上肢水肿”为检索词，各检索词之间自由组合，在中国知网、万方及维普数据库中进行检索，检索时间为建库到2021年11月1日。

1.2 文献筛选标准

1.2.1 纳入标准 符合乳腺癌相关淋巴水肿诊断的临床研究、案例报道等；中药外治疗效确切或中药外治联合用药组优于非联合用药组的文献。

1.2.2 排除标准 缺乏具体药物组成或药物组成未列举完全的文献；重复发表文献；动物实验、综述类文献。

1.3 中药名称规范中药名称的规范以2020年版《中华人民共和国药典》[9]为准，并参考《中华本草》[10]、《本草纲目》[11]。如：“元胡”规范为“延胡索”，“白芥子”规范为“芥子”。并采用古今医案云平台中数据标准化对中药名称进行标准化处理，对于无法进行标准化的名称进行手动修改。

1.4 研究方法

1.4.1 核心药物筛选及用药规律分析 应用古今医案云平台V2.3.5的数据挖掘模块进行中药频数、中药属性（包括四气五味及归经）分析、关联分析、聚类分析。并采用Cytospace 3.8.0软件进行药物共现网络可视化分析，筛选核心药物，对文献中中药外治治疗乳腺癌相关淋巴水肿的用药规律进行分析。

1.4.2 中药成分靶点及疾病靶点筛选 首先通过（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）平台筛选核心药物的化学成分和相应靶点，筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18，并通过Uniprot数据库进行靶点的转换。在GeneCards基因数据库中搜索关键词为“Breast cancer-related lymphedema”相关的靶基因，通过在线维恩图工具（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）筛选两者交集基因。

1.4.3 药物成分-靶点网络构建及可视化 选择药物及疾病的交集靶点，并筛选出药物之间相同的成分用相应字母标识，将生成的Excel表格导入Cytospace 3.8.0软件构建药物成分-靶点网络并进行可视化分析，展示药物成分和靶点间的关系。

1.4.4 基于Bisogenet的PPI网络构建和筛选 借助Cytospace中的Bisogenet插件分别构建乳腺癌相关淋巴水肿靶点和核心药物靶点的蛋白质互作网络（protein-protein interaction,PPI），并通过Merge功能合并两者的网络，应用CytoNCA插件计算合并网络的相关参数并进行PPI网络筛选，筛选条件为：2倍的degree、Betweenness以及Closeness中位数。

1.4.5 GO富集分析和KEGG通路分析 将交集基因上传至Metascape平台（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行GO富集分析和KEGG富集分析，并通过微生信在线绘制气泡图和GO富集分析图。

1.4.6 分子对接 结合Degree值和通路富集分析筛选出核心靶点ESR1和TP53，并选取主要有效成分。检索RCSB PDB和Pub Chem数据库，得到靶点与成分的化学及三维结构，并通过Pymol软件和AutoDockTools进行对接。

2 结 果

2.1 文献检索结果根据纳入标准、排除标准，最后纳入文献48篇，合计48首中药外治方，共143味中药。具体文献筛选情况见图1。

图1 文献筛选流程图

2.2 中药频数、功效统计对48首方剂的中药频数进行统计分析，总计143味中药。排名前5的中药分别为红花、桂枝、黄芪、鸡血藤、当归，频数均大于10。其中红花的频数最高，使用频率占所有处方的41.67%（20/48）。排名前20的中药频数情况见表1。然后进一步对中药的功效进行统计分析，纳入的中药外治方频数前3的功效分别是利水消肿、调经止痛及散瘀止痛，排名前10的中药功效情况见图2。

表1 中药频数表（前20位）

图2 中药功效分布情况饼图（前10位）

2.3 中药四气五味及归经统计分析对143味中药的四气五味进行统计分析，结果显示中药以温性频数最高，其次则为平性和寒性。中药五味包括辛、苦、甘、咸、微苦、淡、酸、微甘、涩，其中辛味频数最高。对中药归经进行统计分析，发现主要以肝经、脾经、肺经为主。（见图3～5）

图3 中药四气雷达图

图4 中药五味雷达图

图5 中药归经雷达图

2.4 中药配伍分析设置置信度≥0.8，支持度≥0.1，对48首外治中药方进行配伍关联分析，最后得到关联数据24条。（见表2）

表2 中药配伍表

2.5 聚类分析对48首方剂频数排名前20的药物进行聚类分析，设置距离类型为欧氏距离，聚类方法为最长距离法。根据距离≥3.5，可将药物分为3组。第一组：黄芪、桑枝、红花、桂枝、鸡血藤；第二组：芒硝、细辛、乳香、芥子、吴茱萸、紫苏子、莱菔子；第三组：泽泻、川芎、甘草、当归、冰片、威灵仙、艾叶和伸筋草。（见图6）

图6 治疗BCRL的高频药物系统聚类图

2.6 核心药物共表达网络分析运用Cytospace 3.8.0软件对所有中药进行共表达网络分析，并筛选出核心药物28个。圆圈大小表示Degree值大小，圆圈越大代表与该药物有作用关系的药物越多，连线的粗细表示药物之间连接的强弱程度。最终得出28味核心药物，其中红花、桂枝、黄芪、鸡血藤为核心药物。（见图7）

图7 治疗BCRL核心药物的共现网络图

2.7 核心药物有效成分、靶点及疾病靶点借助TCMSP平台根据筛选条件，最后分别得出核心药物的有效成分，其中鸡血藤15个、黄芪12个、红花13个、桂枝6个，并通过有效成分找出对应靶点，经过Uniprot转换、去重后得到核心药物的靶点251个。在GeneCards数据库中共检索到BCRL靶基因509个，与核心药物靶基因取交集，最后得到交集靶点60个。

2.8 药物成分-靶点网络构建及分析应用Cytospace 3.8.0构建核心药物成分-靶点的网络，其中“GZ”代表桂枝，“HQ”代表黄芪，“JJT”代表鸡血藤，“HH”代表红花，“GZ1”代表桂枝的有效成分，以此类推。4个药物之间的共有成分则用大写字母表示，“A1”“A2”分别表示鸡血藤和黄芪的共有成分，“B1”表示鸡血藤和桂枝的共有成分，“C1”是鸡血藤、红花、桂枝的共有成分，“D1”是鸡血藤和红花的共有成分，“E1”“E2”则分别是红花和黄芪的共有成分，各成分详见表3，成分-靶点网络见图8。

表3 图8各成分描述

图8 红花-鸡血藤-黄芪-桂枝的成分-靶点网络

2.9 PPI网络构建及筛选通过GeneCards数据库共获得BCRL靶基因509个，分别将核心药物251个靶基因和疾病靶基因导入Cytospace 3.8.0构建药物和疾病的PPI网络，通过Merge功能得到一个由4 251个节点和106 108条边构成的网络，并通过Degree、Betweenness及Closeness 3个参数的2倍中位数进一步筛选，最后得到由64个节点和1 060条边组成的核心网络，并根据Degree值显示形状的大小。结果发现Degree值排名前5的蛋白所对应的基因名分别为NTRK1、TP53、ESR1、CUL3、MCM2，为后续分子对接蛋白筛选提供借鉴。（见图9）

图9 鸡血藤-红花-黄芪-桂枝和BCRL疾病靶点的PPI网络筛选图

2.10 GO富集分析和KEGG通路分析在Metascape数据库中导入交集靶点进行GO富集分析及KEGG通路分析，其中分子功能共84条，生物过程共1 446条，细胞组分共33条，共得到KEGG通路245个。排名前10的生物过程主要包括对无机物、脂多糖、细菌来源分子、上皮细胞增殖等反应，细胞组分包括膜筏、膜微区、线粒体外膜、Bcl-2家族蛋白复合物等，分子功能主要涉及细胞因子受体结合、蛋白域特异性结合、磷酸酶结合、转录因子结合、核受体活性等。根据P值筛选排名前10的信号通路，包括癌症的途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、麻疹、丙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、流体剪切应力和动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、Jak-STAT信号通路。（见图10～11）

图10 鸡血藤-红花-黄芪-桂枝治疗BCRL靶点GO分析图（排名前10）

图11 鸡血藤-红花-黄芪-桂枝治疗BCRL的KEGG通路分析气泡图（排名前10）

2.11 药物核心成分和疾病关键靶点的分子对接根据PPI网络中得出的Degree值结合通路筛选出关键靶点TP53和ESR1，并分别与核心药物的关键成分山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇进行分子对接。结果显示6对分子的结合能均＜-6.0kcal/mol，表示配体分子和受体蛋白结合活性较好。β-谷甾醇与活性位点附近的ASN-439氨基酸形成氢键结合到ESR1，与活性位点附近的SER-166氨基酸形成氢键结合到TP53；山奈酚、槲皮素与活性位点附近的SER-456、GLU-385、ARG-515、LEU-511、THR-483、LEU-479这6个氨基酸形成氢键结合到ESR1；山奈酚与活性位点附近的PRO-222、HIS-233、GLU-198这3个氨基酸形成氢键结合到TP53；槲皮素与活性位点附近的GLU-224、PRO-222、HIS-233、GLU-198这4个氨基酸形成氢键结合到TP53。（见图12）

图12 分子对接模式图

3 讨 论

BCRL在中医学中属于“水肿”范畴。《素问·至真要大论篇》中记载“诸湿肿满，皆属于脾”，故后世医家多从健脾利水着手治疗。张微微等[12]则自拟温阳利水方进行治疗。《景岳全书·肿胀》就曾记载“凡水肿等症，乃肺脾肾三脏相干之病。盖水为至阴，故其本在肾”，强调治肿以肾阳为根本。另外活血化瘀、益气养阴亦为本病的治法。中医外治日渐应用于BCRL的治疗中，研究[13-17]显示中药敷贴、熏蒸、热敷等中药外治法治疗本病疗效显著。然而各家用药多样，对于药物的选择缺乏统一的认识。

淋巴系统由与心血管系统互补的复杂血管和器官网络组成，它在几个生物学事件中起着至关重要的作用，包括免疫反应和间质液体、细胞、分子和组织碎片的动态平衡[18]。尽管有很多研究从基因和分子水平探讨了BCRL的形成机制，但在分子机制方面的研究仍存在挑战。本研究从分子通路水平探讨核心外治中药治疗乳腺癌相关淋巴水肿的疗效机制。

3.1 从中药频数分析用药规律143味中药中高频药物包括红花、桂枝、黄芪、鸡血藤、当归、芒硝、紫苏子、细辛、吴茱萸、川芎、桑枝、莱菔子、威灵仙。红花、鸡血藤、当归、川芎活血通经，桂枝、黄芪温阳益气，芒硝、紫苏子、莱菔子利水消肿，细辛、吴茱萸温阳止痛，桑枝通经止痛。“治水即以治血，治血即以治水。”故活血可以利水，补血可以利水。故中药处方中以活血通经的红花频数最高。乳腺癌患者经过手术或化疗治疗后气血亏虚，气虚无法推动血行，则导致气滞血瘀，水湿停聚，故出现肢体肿胀，沉重。将活血和利水贯穿于治疗始末，方能事半功倍。频数仅次于红花的药物是桂枝，桂枝具有温通经脉、助阳化气之功，少佐桂枝可达到温化水湿之效。“气行则血行”，黄芪通过益气达到活血通经的作用，行气利水，通利水湿，使肿胀自去。

3.2 从四气五味及归经分析用药规律中药外治方中温、平、寒性药物居多，而其中温性药物占比最高。温性药具有温通经脉、通经散寒之功。药味则以辛、苦、甘为主。辛味能散能行，具有行气活血的作用；苦味能泄能燥，具有燥湿软坚的作用。而药物归经则以肝经频数最高。肝主疏泄，可调畅三焦的气机，从而促进水液代谢。

3.3 从中药配伍分析用药规律分析中药的配伍对于指导临床选用药物具有一定意义。本研究分析了中药外治方的配伍情况，常用的配伍包括鸡血藤-红花、鸡血藤-桂枝、吴茱萸-紫苏子、紫苏子-莱菔子等。鸡血藤是补血活血要药，《饮片新参》记载其能“去瘀血，生新血，流利经脉。”现代药理学表明[19]，鸡血藤可以促进红细胞的生成，提高血红蛋白的含量。而红花的活血能力较强，主要取其活血化瘀之效，因此红花和鸡血藤相须为用，共奏补血活血之功，补而不滞。桂枝外用可温阳通脉、化气行水[20]，桂枝和鸡血藤联用可加强通利血脉之功。其他几组配伍，取散寒止痛的吴茱萸和降气化痰的紫苏子。莱菔子和紫苏子则来自三子养亲汤，行气化饮。

3.4 从聚类分析分析用药规律通过对频数前20的中药进行聚类分析，以组为单位找到文献中外用药的配伍情况，可为用药提供参考。第一组：黄芪、桑枝、红花、桂枝、鸡血藤。红花、鸡血藤活血补血，桂枝温通经脉，桑枝通经络行水气，从而达到消肿之用，佐以黄芪补气利水。第二组：细辛、乳香、芥子、吴茱萸、紫苏子、莱菔子。该组方主要为三子养亲汤加减用药，三子养亲汤主要用于痰浊壅盛，加上吴茱萸散寒止痛，细辛化饮止痛，乳香消肿通经，共同起到消肿通经的作用。第三组：泽泻、川芎、甘草、当归、冰片、威灵仙、艾叶、伸筋草。当归补血活血，川芎行气活血，威灵仙和伸筋草共奏舒筋活络之效，艾叶、冰片止痛，甘草缓急止痛。

3.5 共表达网络分析用药规律为了更加直观分析药物之间的相关性，通过构建共表达网络分析寻找核心药物并分析其相互作用。本研究应用Cytospace软件进行共表达网络的构建，通过颜色的深浅及节点的大小，发现筛选出的28个核心药物中，红花、鸡血藤、黄芪、桂枝的连接紧密，可作为后续选用外敷药的参考。

BCRL与气滞血瘀关系密切，临床上用药也多选用活血化瘀、行气活血、利水消肿的药物[21-23]，且中药外治通过皮肤直达患处，使水肿更易于吸收消散，且临床疗效显著。共表达网络分析最终筛选出的4味中药不仅具有活血行血之效，还具有通利经脉、行气利水之功。与临床用药指导思想一致，具有较好的实际应用性。

3.6 靶点和通路分析BCRL的发病机制尚未明确[24]，其影响因素包括手术切口、清扫淋巴结数量、肥胖、激素、基因、高血压和糖尿病等[25-28]。本研究通过分析核心药物的作用靶点和相关通路，旨在探究治疗乳腺癌相关淋巴水肿的可能作用机制。通过PPI网络的筛选结合KEGG通路富集分析，最后得出两个关键靶基因：ESR1和TP53。在既往研究中，与乳腺癌相关淋巴水肿易感性有关的基因主要包括LCP2、VCAM1等[29-30]。本研究则发现中药外治的治疗靶基因是ESR1和TP53，对之前研究结果进行了补充。ESR1即雌激素受体1，与雌激素受体抵抗和乳腺癌密切相关。已有研究[31]表明女性激素（如黄体酮和雌激素）是调节淋巴生理的关键因素，在淋巴水肿的发生发展中具有重要作用。除此之外，淋巴管内皮细胞（LEC）可表达孕激素和雌激素受体。上述研究都证实雌激素受体可能是治疗BCRL的靶点之一。鸡血藤、桂枝、黄芪、红花组成的核心药物可能通过调节ESR1从而影响淋巴管内皮细胞。而TP53基因主要与诱导细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢变化相关[32]。筛选排名前10的信号通路，发现AGE-RAGE相关信号通路、IL17等与核心药物的作用机制中密切相关。其中AGE-RAG轴的活化可参与到多项下游信号通路的激活，如参与糖尿病肾病的氧化应激、炎症及纤维化的过程[33-34]。核心药物可能通过抑制AGE-RAGE轴的活化，从而调节糖尿病肾病的进程，发挥其减轻水肿的作用。已有研究[35]证实在BCRL患者的循环DNA中发现了促炎性细胞因子（如IL1、IL2、IL8、IL17、NFKB2）和抗炎细胞因子（如IL4、IL10、IL13）的变化，中药可能通过调节炎症因子的表达治疗疾病。因此，网络药理学的分析结果对之前的发现进行了补充和验证，为后续探讨乳腺癌相关淋巴水肿的分子机制提供借鉴。

3.7 分子对接分析本研究筛选的药物有效成分及基因靶点均成功对接，且结合能均＜-5.0 kcal/mol。其中山奈酚、槲皮素和ESR1的结合能均＜-7.0 kcal/mol，具有强烈的结合活性。

4 总 结

本研究通过古今云医案平台进行数据管理和分析，并应用数据挖掘相关技术及网络药理学分析筛选已有文献中证实有确切疗效的中药外治方中的核心药物，并进行了可能机制的探讨，为临床上治疗乳腺癌相关淋巴水肿外治方的选择提供了借鉴，也为后续的机制探讨奠定了基础。