细胞周期相关因子3在乳腺癌组织中的表达及对乳腺癌细胞增殖的影响

吴元肇，曾 勇，郑克思，陈艳梅

(温州市人民医院 1.肿瘤外科；2.病理科，浙江 温州 325000)

乳腺癌作为国内外常见的女性恶性肿瘤，是导致女性死亡的主要原因之一。根据2022年美国癌症协会(ACS)统计，预计在2022年，中国发病率前5位的癌症为肺癌、肠癌、胃癌、肝癌与乳腺癌。临床常通过局部手术联合化疗、内分泌治疗以及靶向药物等综合手段治疗乳腺癌，患者往往能得到较好救治。然而，对于特殊类型三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，临床暂无有效内分泌治疗方法及靶向策略。另外，临床观察发现，对于内分泌治疗和靶向药物有效的患者，在经过一线及二线治疗后，常产生耐药性，极大限制了其治疗效果。因此，对乳腺癌的发生发展机制进行深入研究，对寻找新的治疗靶点、开发新型治疗方法具有极大临床意义。

细胞周期相关因子3(cell division cycle associated protein 3,CDCA3)，作为F Box蛋白，是细胞有丝分裂过程中必需的胞质蛋白，对细胞周期、DNA复制等多种生物过程具有重要的调节作用。研究表明，CDCA3在多种恶性肿瘤发生发展过程中均呈高表达水平，抑制CDCA3蛋白表达，可降低肿瘤细胞活性，抑制肿瘤细胞增殖。然而，CDCA3在乳腺癌中的表达和功能研究较少。因此，本课题组收集临床不同分期乳腺癌组织，利用生化实验结合生物信息学方法分析CDCA3蛋白水平与乳腺癌预后的相关性；同时构建稳定敲低CDCA3基因的乳腺癌细胞株，进一步研究CDCA3在乳腺癌致病机制中的作用，以期为乳腺癌的靶向治疗提供临床实验基础。

1 材料与方法

1.1 免疫组化检测CDCA3在乳腺癌组织标本中的表达 收集我院2020年1月—10月乳腺癌标本库中乳腺癌组织(不同组织型或者不同分期如早期中期晚期)41例，癌旁组织标本40例。本研究通过温州市人民医院伦理委员会审核并备案。采用免疫组化法检测乳腺癌组织和癌旁组织中CDCA3的表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作(CDCA3抗体：Amresco)，试剂盒购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司。倒置显微镜下，根据细胞染色的强弱直观评分：-阴性(无染色)，+弱阳性(淡黄色)，++阳性(棕黄色)，+++强阳性(棕色)。

1.2 GEPIA平台分析CDCA3在乳腺癌组织中的表达情况 通过GEPIA平台(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析相对于正常乳腺组织，乳腺癌中CDCA3基因表达的差异，基因名称选择“CDCA3”，Dataset(Cancer name)选择“BRCA”。

1.3 Kaplan-Meier Plotter数据平台分析CDCA3与乳腺癌预后的关系 登录Kaplan-Meier Plotter数据平台(http://kmplot.com/analysis/)，检索CDCA3基因，获得CDCA3基因表达差异患者的生存曲线(对肿瘤病理类型及临床分期、分级等不做限制)。

1.4 细胞株构建与CDCA3检测 利用shRNA构建稳定干扰CDCA3表达的乳腺癌MCF7细胞株(Sh1，Sh2)及对照组细胞(NC)。培养MCF7乳腺癌细胞株(培养基：DMEM+10%FBS，细胞培养条件为5% CO，37 ℃)，DMEM购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Gibco公司；胰酶和DMSO购自美国Amresco公司。通过慢病毒包装系统构建稳定干扰CDCA3基因表达的乳腺癌细胞株(PLKO.1-CDCA3shRNA)及对照组细胞(汉恒生物，siRNA: Invitrogen，美国)。

取对数期细胞，PBS冲洗3遍，蛋白提取试剂盒提取总蛋白(Pierce，美国)，加入5×上样缓冲液，100 ℃ 水浴锅煮沸5 min后冷却待用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，移至PVDF膜，于脱脂牛奶中室温封闭1 h，PBST洗膜10 min×3次，一抗稀释液4 ℃ 孵育过夜，次日PBST洗膜10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液室温反应2 h，PBST洗膜10 min×3次，ECL显影并分析条带灰度。

1.5 细胞增殖检测 分别收集对数生长期的稳定干扰CDCA3基因表达的MCF7细胞和对照组细胞，血球计数板计数后加入四块96孔板中，5 000个细胞/孔，每个孔加入100 μL培养基，设置3复孔。待细胞贴壁后取出一块96孔板，每孔中加入10 μL CCK8溶液作为起始对照样本，37 ℃、5% CO细胞培养箱内继续孵育0.5 h，于分光光度计450 nm波长处测定吸光值，保存数值。另三块96孔板按药物浓度依次加入含药培养基，终体积100 μL，37 ℃、5% CO条件下分别培养24 h、48 h、72 h。取出加药的96孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO细胞培养箱内继续孵育0.5 h，450 nm测定吸光值，保存数值并分析。

1.6 乳腺癌细胞周期变化检测 收集转染48 h后的细胞，清洗离心后用固定液配置细胞悬液(1×10个/mL)，加入10 μL试剂B(70-APCC101，联科生物，中国)，室温避光孵育30 min。利用流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)、软件FACS express version 3，分析细胞周期变化情况。

1.7 基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA) 通过GEO数据库下载5套亚洲人乳腺癌基因芯片数据集(GSE6367、GSE9309、GSE15852、GSE33447和GSE45255)，共获得318例乳腺癌和60例正常乳腺组织的基因表达谱数据。根据CDCA3基因表达水平高低分为两组，利用GSEA(GSEA3.0版本)分析CDCA3的表达水平对各种生物通路基因集的影响。按默认加权富集统计方法，以从GSEA网站MsigDB数据库中获得的基因集作为参照基因集，置换次数为1 000次。

1.8 统计方法 采用Graghpad Prism 8.0软件进行数据分析，计量资料组间比较应用Anova联合检验。<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDCA3在乳腺癌组织中的表达水平 本院标本的免疫组化分析结果显示，乳腺癌组织中CDCA3蛋白表达量(1.83±0.72)显著高于癌旁组织(1.02±0.51)，差异有统计学意义(<0.001)。GEPIA数据平台中，共收集正常乳腺组织112例、乳腺癌组织1 085例，分析结果显示，CDCA3在乳腺癌中的表达水平显著高于正常乳腺组织，差异有显著统计学意义(<0.05)，见图1。

图1 CDCA3在乳腺癌组织及癌旁组织(正常组织)中表达量的比较

2.2 CDCA3表达与乳腺癌患者预后的关系 Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示，高表达CDCA3的乳腺癌患者50个月总体生存率(57.21%)低于CDCA3低表达者(70.22%)，差异具有统计学意义(<0.05)，见图2。

图2 CDCA3表达水平与乳腺癌患者预后的相关性

2.3 各组乳腺癌MCF7细胞增殖情况 Western blot检测结果显示，与对照组相比，Sh1组和Sh2组的CDCA3蛋白表达量明显降低，可稳定敲低CDCA3表达(图3A)。CCK8检测结果显示，与对照组相比，Sh1组和Sh2组在48 h和72 h的细胞增殖出现显著抑制，差异具有统计学意义(<0.05)，见图3B。

A.各组细胞中CDCA3蛋白表达量；B.各组细胞的增殖情况；与对照组(NC)比较，*P<0.05。

2.4 下调CDCA3后肿瘤细胞周期变化 流式细胞仪检测结果显示：与对照组(NC)细胞相比，敲低CDCA3后的MCF7细胞株(Sh1，Sh2)G1期显著延长，差异具有统计学意义(< 0.05)，细胞周期的S、G2期差异无统计学意义(> 0.05)，见图4。

与对照组(NC)比较，*P<0.05。

2.5 各组细胞NF-кB信号转导通路相关蛋白表达情况 免疫印迹实验结果显示，下调CDCA3表达后，与对照组相比，Sh1组和Sh2组的NF-кB1(p50)、RelA(p65)蛋白表达减少，差异具有统计学意义(< 0.05)，见图5。

A.各组细胞免疫印迹实验结果；B.各组细胞NF-кB1(p50)蛋白表达；C.各组细胞RelA(p65)蛋白表达；与对照组(NC)比较，*P<0.05。

2.6 CDCA3高表达样本的富集基因集 利用GSEA分析平台对CDCA3高表达的乳腺癌细胞样本富集基因进行分析，结果如表1所示：CDCA3高表达的乳腺癌细胞存在与NF-кB信号通路、E2F信号通路、mTOR信号通路、有丝分裂纺锤体、PI3K-AKT-mTOR信号通路、G1S 检查点、糖酵解、未折叠蛋白反应、胆固醇平衡等相关的基因集。

表1 CDCA3高表达的乳腺癌样本的GSEA

3 讨论

乳腺癌被认为是危害女性健康的“头号杀手”,并以每年3.1%的速度增长。现有靶向治疗方法(如HER-2抗体或内分泌治疗)虽有较好的疗效，但无法适用于所有乳腺癌患者，且常会不可避免地产生耐药等问题。因此，探索乳腺癌发生发展高敏感性生物学指标，找寻新的生物治疗靶点具有重大临床意义。

已报道CDCA3是胃癌的潜在诊断标志物，可以促进胃癌细胞的生长。结直肠癌中，上调的CDCA3表达与结直肠癌的浆膜浸润、TNM分期呈正相关。在非小细胞肺癌中，CDCA3能够通过降解细胞周期抑制分子，进一步促进肿瘤细胞增殖，已被作为非小细胞肺癌的诊断标志物和治疗靶点。已有实验证实，前列腺癌中Homeobox B3可通过绑定到CDCA3启动子区，活化CDCA3蛋白，促进前列腺癌的发展进程。然而，乳腺癌中CDCA3的具体机制仍未完全清晰。

本研究结果显示，在收集的乳腺癌患者样本中，乳腺癌组织CDCA3的表达量显著高于癌旁组织，TCGA数据库分析亦显示CDCA3基因在乳腺癌中的表达水平显著高于正常乳腺组织。同时，通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示，CDCA3表达与乳腺癌患者的预后呈负相关，提示CDCA3低表达的患者具有更好的生存时间和预后转归。进一步利用慢病毒包装系统，成功构建稳定敲低CDCA3的乳腺癌细胞株，CCK8细胞增殖检测结果显示CDCA3基因干扰能够显著抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖活性，提示CDCA3在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。

CDCA3为细胞周期分裂相关蛋白家族成员，是S期激酶相关蛋白1(SKP1)/淘汰素(Cullin1)/F-box(SCF)E3泛素连接酶复合物的一部分，可通过调节有丝分裂抑制激酶weel的降解过程，介导细胞周期的进展，被称为进入有丝分裂的“触发因子”。前期研究报道证实，结肠癌细胞SW480中敲减CDCA3后，在体内和体外均可观察到细胞增殖出现显著抑制，其可能机制为细胞周期G1到S期的转换停滞。而本实验中我们同样观察到，CDCA3下调后细胞周期的G1期显著延长，且可能与调节增殖相关NF-кB通路蛋白相关。另一方面，GSEA分析结果显示，CDCA3亦可能通过多种与细胞周期相关的生物学过程(如G1S检查点、未折叠蛋白反应、有丝分裂纺锤体等)、多种与肿瘤增殖相关的信号通路(E2F信号通路、NF-кB信号通路、mTORC1以及PI3K-AKT-mTOR信号通路)以及多种代谢相关的生物学过程(糖酵解和脂肪平衡)调节乳腺细胞增殖，促进癌细胞生长。

综上所述，CDCA3在乳腺癌组织中表达显著增加，且CDCA3的表达水平与乳腺癌患者的预后呈显著负相关，在乳腺癌细胞中干扰CDCA3表达可显著抑制乳腺癌细胞增殖。同时，结合生物信息学分析提示CDCA3可能是乳腺癌进展的关键分子，是预防和治疗乳腺癌的潜在生物标志物和治疗靶点。但是，本研究尚未对CDCA3促进乳腺癌的发生发展的机制进行研究，将在今后研究中进一步探索。