有氧运动对APP/PS1小鼠海马内质网应激--细胞自噬偶联的影响

夏 杰，赵 娜，王 璟，李百侠，徐 波*

（1.华东师范大学 体育与健康学院，上海 200241；2.华东师范大学“青少年健康评价与运动干预”教育部重点实验室，上海 200241）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种起病隐袭、呈进行性发展的神经退行性疾病，临床特征主要为认知障碍、精神行为异常和社会生活功能减退（中华人民共和国国家卫生健康委员会，2020）。2020年数据显示，中国60岁及以上的人群中，AD患者达到983万例，轻度认知障碍患病高达3 877万人（Jia et al.，2020）。然而目前临床上尚缺乏对AD有效的治疗药物或手段，其发病机制和治疗措施尚需进一步探究。流行病学研究表明，运动可以降低老年人认知能力下降和患老年痴呆症的风险（Hamer et al.，2018；Livingston et al.，2017）。然而，运动干预AD的作用机制尚不清楚。

近年来的研究认为，AD属于蛋白质稳态失衡的疾病，主要表现为蛋白质错误折叠和异常蛋白质清除途径受 损（Boland et al.，2018；Hipp et al.，2019；Uddin et al.，2021）。和是AD发病的2个关键基因，的突变可能导致该基因在蛋白合成过程中错误折叠增加；突变可导致内质网蛋白质稳态失衡（Ryazantseva et al.，2018；Tong et al.，2016）。因此，和基因突变可能是导致AD脑内蛋白质稳态失衡的关键。内质网是调控蛋白质稳态的重要细胞器，当内质网中错误折叠蛋白质累积时，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）被诱导并启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），通过抑制蛋白质合成和促进降解等途径恢复内质网蛋白质稳态（Hetz et al.，2017）。细胞自噬是神经细胞UPR激活的主要降解途径，该功能失调与AD发病密切相关（Nijholt et al.，2011）。蛋白激酶样内质网激酶（protein kinaselike endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核翻译起 始 因 子 2α（eukaryotic translation initiation factor2α，eIF2α）是UPR中的关键信号，在AD病理机制中发挥重要作用。研究发现，AD患者和动物模型脑内存在ERS和PERK/eIF2α 过度激活（Murray et al.，2020；Oliveira et al.，2021）。进一步研究认为，AD脑内表现为过度激活的PERK/eIF2α和无效的细胞自噬，这说明AD脑内可能存在ERS-细胞自噬途径异常（Cai et al.，2016a）。因此，靶向调节ERS和细胞自噬途径可能是缓解AD病理的有效途径。钙网蛋白（calreticulin，CRT）是一种内质网分子伴侣，在蛋白质折叠和质量控制发挥作用。近期研究显示，CRT在ERS状态下表达增加，并可通过与微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）结合偶联ERS与自噬，并认为激活CRT-细胞自噬信号的药理学或遗传学方法可能具有调节ERS及其相关疾病的潜力（Yang et al.，2019）。研究已证实，AD 患者脑内 CRT的mRNA水平和蛋白水平均有所降低（Taguchi et al.，2000）；血清CRT水平可作为AD患者诊断的生物标志物（Lin et al.，2014）。因此，本研究推测CRT介导的ERS-细胞自噬偶联可能参与AD病理机制。

运动科学领域研究发现，运动可以缓解糖尿病小鼠、卒中大鼠和AD小鼠脑组织的ERS（Cai et al.，2016b；Hong et al.，2020；Li et al.，2021）。报道的一项研究发现，有氧运动诱导分泌的Irisin可以阻止Aβ寡聚体导致的ERS相关分子表达升高（Lourenco et al.，2019）。本课题组前期研究发现，有氧跑台运动可以缓解APP/PS1小鼠海马的ERS、下调PERK/eIF2α信号和提高自噬活性（赵娜 等，2019；Xia et al.，2019）。这提示，运动可能调节AD模型小鼠脑内ERS和细胞自噬。然而，ERS与细胞自噬在运动改善AD病理中的交互调控机制尚需深入探讨。

基于此，本研究从ERS与细胞自噬偶联的角度，探究3个月的中等强度有氧运动对APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠海马Aβ病理、ERS、细胞自噬以及ERS-细胞自噬偶联的影响，以阐明运动调节APP/PS1小鼠海马ERS-细胞自噬偶联机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

C57BL/6系的雄性 APPswe/PS1dE9（APP/PS1）转基因小鼠及雄性野生型（Wild Type，WT）小鼠购自南京大学模式动物研究所。所有小鼠在控制温度（22±2）℃、湿度50%±10%和12 h的明暗循环条件中饲养，自由摄取水和饲料。自3月龄开始，将APP/PS1转基因小鼠和WT小鼠分为4组：野生型对照组（WT-Sed，=11）、野生型运动组（WT-Exe，=11）、APP/PS1对照组（APP/PS1-Sed，=11）和APP/PS1运动组（APP/PS1-Exe，=11）。本实验经华东师范大学实验动物保护与使用委员会批准（m20190405）。

1.2 运动方案

1.3 取材

实验干预结束后，每组取5只小鼠，进行深度麻醉（i.p.10%水合氯醛，3.5 mL/kg体质量），经心脏灌注预冷的PBS，随后取脑组织。将左侧半脑的海马组织取出，提取组织总RNA，用于Real-time PCR实验。将右侧半脑置于多聚甲醛（4%）中进行固定，于次日进行脱水、包埋、制成石蜡切片（4 μm），用于免疫组化和免疫荧光实验。每组另取6只小鼠，经深度麻醉后处死，剥离左右双侧海马，提取组织总蛋白，用于Western blotting和Simple western实验。

1.4 蛋白质样品制备

使用含有蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取海马组织总蛋白。简明操作步骤如下：将海马组织（20 mg）装入含有500 μLRIPA裂解液的匀浆管中，装入3颗磁珠。以3.55 m/s的速度进行匀浆，匀浆时间为30 s，重复3次。匀浆结束后，在4℃条件下以12 000 g的速度离心10 min，收集上清液。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，收集的蛋白质样品用于Western blotting和Simple western实验。

1.5 Western blotting

Western blotting按以下步骤进行：将提取的蛋白质样品与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，使最终浓度为5 μg/μL。在95 ℃条件下变性5 min，制成Western blotting待测样本。随后依次进行上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显影等步骤。最后采用FluorChem FC2软件计算条带的灰度值，以β-Actin为内部参照，计算出目标蛋白的相对表达量。抗体信息如下：LC3（1∶1 000，Affinity，AF5402）、P62（1∶1 000，Affinity，AF5384）、β-Actin（1∶1 000，Affinity，T0022）、HRP标记的山羊抗兔（1∶3 000，Affinity，S0001）。

1.6 Simple western

Simple western实验采用Wes全自动蛋白表达分析系统（ProteinSimple，美国）进行。采用ProteinSimple公司提供的试剂盒（12-230kDa Wes Separation Module 8×25 capillary cartridges，SM-W004）和二抗（Anti-Rabbit Detection Module for Wes，DM001）完成实验。简明操作步骤如下：1）准备蛋白质样品。将提取的蛋白质样本进行BCA定量，将蛋白浓度稀释为5 μg/μL。2）准备Wes仪器并运行开机自检程序。3）加样。首先配置DTT、5×Master Mix（即Loading Buffer）、Ladder（即分子量标准品）、样品（检测常规蛋白和磷酸化蛋白的样品终浓度分别为1.5 μg/μL和3 μg/μL）、抗体和发光液。开始加样，从ProteinSimple试剂盒里取出微孔板，将配制好的试剂依次加入微孔板的A～F行。加样完成后，盖上微孔板盖子，RT条件下2 500 r/min离心10 min，检查并确认微孔板的底部无气泡。4）上机操作。打开软件，按照说明书上的步骤设置运行参数。打开Wes仪的仓门，并将ProteinSimple试剂盒里的毛细管放入Wes仪器。将微孔板放入Wes仪器。关闭仓门，锁止后点击Start运行。5）运行结束和数据分析。运行结束后，依次完成检查荧光内参、Ladder、Sample，数据和图片导出等步骤。6）目的蛋白相对表达量的计算。对于常规蛋白，以GAPDH为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。对于磷酸化蛋白，则以该蛋白的总蛋白为内部参照，计算磷酸化蛋白的相对表达量。本实验使用的抗体信息如下：PERK（1∶50，Affinity，AF5304） 、p-PERK（1∶ 100，Affinity，DF7576）、eIF2α（1∶50，Affinity，AF6087）、p-eIF2α（1∶50，Affinity，AF3087）、ATF4（1∶50，Affinity ，DF6008）、CRT（1∶50，Affinity，DF6211）、GAPDH（1∶150，Affinity，AF7021）。

1.7 Real-time PCR

使用Trizol试剂提取海马组织总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用HieffqPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）试剂盒（上海翊圣，11202ES03），按照 10 μL的 HieffqPCR SYBR Green Master Mix，7.6 μL蒸馏水，0.2 μL上游引物，0.2 μL下游引物，2 μL的cDNA样本，配制20 μL的反应体系。在QuantStudio3 and 5 Real-time PCR系统上完成检测。根据检测的Ct值，以为内参基因，采用2的方法计算出目的基因mRNA相对表达量。基因引物序列如下：（F：AATGTGTCCGTCGTGGATCTGA；R：AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC）、（F：AAGGTACAAGGGAGTGGGTG；R：ACCCGGAATACCCTAGACCT）、（F：AGGTAACCCAACGCCTTCTT；R：GAGACGAGAGCAAGGAATGG）、（F：GTCCCCAAGGAGGATGGTAT；R：ACCAAGCCCATCTCAACATC）、（F：AACATTCGTTGCCCAAACTC；R：TTTCATGCCCACAGTCACAT）、（F：CACCTGTGAGTGGGGCTAAT；R：CACCTTGACTGGTCCCTTGT）。

1.8 免疫组织化学实验

1.8.1 Aβ染色

简明步骤如下：1）脱蜡至水。2）抗原修复。使用柠檬酸抗原修复缓冲液（pH：6.0）进行抗原修复。3）阻断内源性过氧化物酶。在含有3%（HO）的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲盐水（pH：7.4）中处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性。4）BSA封闭。5）加一抗。一抗采用Anti-Aβ antibody（1∶1 000，Abcam，ab201060）。6）加二抗。采用HRP标记的山羊抗兔（1∶200，Servicebio，GB23303）。7）DAB显色。加入DAB显色液并控制显色时间，阳性为棕黄色。8）复染细胞核。苏木素复染、分化、返蓝。9）脱水封片。10）镜检。利用显微镜（Nikon，E100）和成像系统（Nikon，DS-U3）采集图像。11）图像分析。利用Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）分析背侧海马齿状回（Dentate gyrus，DG）的Aβ斑块水平。

1.8.2 APP/GRP78、CRT/LC3免疫荧光双重标记

免疫荧光双重标记实验采用TSA荧光双重染色试剂盒（Servicebio，G1235-100T），按照说明书进行。简明步骤如下：1）脱蜡至水。2）抗原修复：EDTA抗原修复缓冲液（pH：8.0）进行抗原修复，并微波炉加热处理。3）画圈标记。4）滴加组织自发荧光淬灭剂（Servicebio，G1221）A液，室温孵育30 min。5）阻断内源性过氧化物酶：同步骤3。6）BSA封闭。7）一抗孵育：加入第一种一抗，Anti-GRP78 antibody（1∶50，Affinity，AF5366）、Anti-CRT antibody（1∶50，Affinity，DF6211），4 ℃孵育过夜。8）二抗孵育：HRP标记的山羊抗兔（1∶200，Servicebio，GB23303），室温孵育50 min。9）加TSA-FITC染色工作液，室温避光孵育10 min。10）微波处理：使用EDTA抗原修复缓冲液（pH：8.0）进行抗原修复，并进行微波炉加热处理。11）重复步骤7：加第二种一抗 ，Anti-APP antibody（1∶100，Affinity，AF7687）、Anti-LC3 antibody（1∶1 000，Affinity，AF5402），4℃孵育过夜。12）重复步骤8。13）滴加TSA-CY3染色工作液，室温避光孵育10 min。14）细胞核复染：滴加DAPI染色液，室温避光孵育10 min。15）组织自发荧光淬灭：加组织自发荧光淬灭剂B液，室温孵育5 min。16）封片及镜检：滴加抗荧光淬灭封片剂封片。采用荧光显微镜（Nikon Eclipse C1）和成像系统（Nikon DS-U3）采集图像。紫外激发下DAPI发蓝光，FITC发绿光，CY3发红光。17）图像分析。利用Image-Pro Plus6.0软件分析背侧海马DG区分子层（molecular layer，ML）APP与GRP78、CRT与LC3的荧光强度及共定位水平（Pearson’s correlation coefficient）。

1.9 生物信息学分析

利用生物信息学数据库iLIR Autophagy Database（Kalvari et al.，2014）（https：//ilir.warwick.ac.uk/）对 CRT 蛋白序列进行分析，根据CRT蛋白序列中是否具有LIR motif（LC3结合区域）来预测该蛋白能否介导自噬。具体方法如下，利用 UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）查询CRT的蛋白序列，将获得的CRT蛋白序列（FASTA格式）输入iLIR数据库中，进行LC3结合区域分析。

1.10 数据统计分析

采用双因素方差分析，以基因和运动作为两个因素，多重比较采用Bonferroni法。数据以平均值±标准误（±）形式呈现，统计学意义设为＜0.05或＜0.01。

2 实验结果

2.1 运动对小鼠海马Aβ斑块水平的影响

采用免疫组化检测各组小鼠海马组织Aβ斑块水平，并利用IPP 6.0软件对Aβ染色进行光密度分析。结果如图1所示，与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马Aβ斑块水平显著升高（＜0.01）。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马Aβ斑块水平显著降低（＜0.05）。

图1 APP/PS1转基因和运动对小鼠海马Aβ斑块水平的影响Figure 1.Effects of APP/PS1 Transgene and Exercise on Aβ Plaque in Mice Hippocampus

2.2 运动对小鼠海马APP/GRP78共定位水平的影响

采用免疫荧光技术对海马组织APP和GRP78进行免疫荧光染色，如图2A所示，荧光显微镜视野中的红色荧光为APP，绿色荧光为GRP78，蓝色荧光为细胞核。采用IPP 6.0软件对各组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平、APP和GRP78的平均荧光强度进行分析。与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平显著升高（＜0.01，图 2B）、APP（＜0.05，图2C）和GRP78（＜0.01，图2D）的平均荧光强度显著增加；APP/PS1-Exe组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平显著升高（＜0.05，图2B）。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马DG区APP/GRP78共定位水平显著降低（＜0.01，图2B），GRP78的平均荧光强度显著减少（＜0.05，图2D）。

图2 各组小鼠海马APP和GRP78免疫荧光分析Figure 2.Immunofluorescence Analysis of APP and GRP78 in Mice Hippocampus

2.3 运动对小鼠海马PERK/eIF2α信号通路的影响

采用Simple western技术对小鼠海马组织PERK/eIF2α信号通路蛋白进行定量分析。如图3所示，与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马p-PERK（＜0.05，图3A、D）和 p-eIF2α（＜0.01，图3B、D）的蛋白水平显著升高。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马p-PERK（＜0.05，图3A、D）和p-eIF2α（＜0.01，图3B、D）的蛋白水平显著降低。与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马ATF4的蛋白水平显著升高（＜0.01，图3C、D）。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马ATF4的蛋白水平显著降低（＜0.01，图3C、D）。

图3 APP/PS1转基因和运动对小鼠海马PERK/eIF2α信号通路的影响Figure 3.Effects of APP/PS1 Transgene and Exercise on Hippocampal PERK/eIF2α Signaling in Mice

2.4 运动对小鼠海马自噬相关分子表达的影响

采用Real-time PCR检测了自噬相关基因的和的mRNA水平。如图4A～D所示，与WT-Sed组相比，WT-Exe组小鼠海马的mRNA水平显著升高（＜0.01，图4B），的mRNA水平显著降低（＜0.05，图4C）；APP/PS1-Sed组小鼠海马（＜0.05，图4A）和（＜0.01，图4C）的 mRNA水平显著降低，的mRNA水平显著升高（＜0.05，图4D）；APP/PS1-Exe组的mRNA水平显著降低（＜0.01，图4C），的 mRNA 水平显著升高（＜0.01，图4D）。与WT-Exe组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马（＜0.01，图4A）和（＜0.01，图4B）的mRNA水平显著降低，的mRNA水平显著升高（＜0.01，图4D）。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马的mRNA水平显著升高（＜0.01，图4D）。

图4 APP/PS1转基因和运动对小鼠海马细胞自噬的影响Figure 4.Effects of APP/PS1 Transgene and Exercise on Autophagy in Mice Hippocampus

采用Western blotting技术检测了小鼠海马LC3和P62的蛋白水平。如图4E、F所示，与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马LC3Ⅱ（＜0.05，图4E）和P62（＜0.05，图4F）的蛋白水平显著升高。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马P62的蛋白水平显著降低（＜0.05，图4F）。

2.5 运动对小鼠海马CRT介导的ERS-细胞自噬偶联的影响

采用生物信息学数据库iLIR web server对CRT蛋白序列进行分析，如图5A所示，CRT蛋白序列的结合域（Pfam）存在LC3结合区，说明CRT可能介导细胞自噬。采用Real-time PCR技术和Simple western技术检测海马组织CRT的表达。如图5B、C所示，与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马的mRNA水平（＜0.01，图5B）和蛋白水平（＜0.01，图5C）均显著降低。与WT-Exe组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马的mRNA水平显著降低（＜0.05，图5B），而CRT的蛋白水平显著升高（＜0.05，图5C）。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马CRT的蛋白水平显著升高（＜0.05，图5C）。

图5 各组小鼠海马CRT和LC3免疫荧光分析Figure 5.Immunofluorescence Analysis of CRT and LC3 in Hippocampus of Mice

采用免疫荧光技术对海马组织CRT和LC3进行荧光染色，如图5D所示，荧光显微镜视野中观察到的绿色荧光为CRT，红色荧光为LC3，蓝色荧光为细胞核。采用IPP 6.0软件对各组小鼠海马DG区CRT/LC3共定位水平、CRT和LC3的平均荧光强度进行分析。分析结果显示，与WT-Sed组相比，APP/PS1-Sed组小鼠海马DG区CRT的平均荧光强度显著减少（＜0.01，图5F），LC3的平均荧光强度显著增加（＜0.01，图5G）；APP/PS1-Exe组小鼠海马DG区LC3的平均荧光强度显著增加（＜0.01，图5G）。与APP/PS1-Sed组相比，APP/PS1-Exe组小鼠海马DG区CRT的平均荧光强度显著增加（＜0.01，图5F）。

3 分析与讨论

3.1 跑台运动减少APP/PS1小鼠海马内质网APP积累

瑞典突变型（APPswe）和基因 dE9突变（PS1dE9）是家族性AD中筛选出的2个突变基因。然而，和基因突变导致的AD病理发生机制目前尚不明确。因此，本研究采用表达APPswe和PS1dE9的双转基因小鼠探究AD的发病机制，并在此基础上探究运动干预的效果和分子机制。以往研究表明，APP/PS1小鼠自3月龄开始，Aβ生成逐渐增加，至6月龄时期已经形成Aβ斑块，并表现出学习记忆和认知缺陷（Zhou et al.，2020）。本研究发现，APP/PS1转基因导致小鼠在6月龄时期表现出海马Aβ斑块显著增加，而跑台运动可以显著降低APP/PS1小鼠海马Aβ斑块水平。因此，3个月的跑台运动可以预防APP/PS1转基因所诱导的AD标志性病理。

鉴于APP和PS1可定位于内质网，基因突变可以破坏内质网功能，而的突变可以引起其在合成过程中错误折叠的增加（Ryazantseva et al.，2018；Tong et al.，2016）。因此，和基因突变导致的AD病理可能与ERS有关。GRP78是内质网中的伴侣分子，当内质网中错误折叠蛋白质增加，GRP78则合成增加并与错误折叠蛋白质结合，因此GRP78也是反映ERS的标志分子。有研究显示，在ERS状态下，GPR78可以与APP结合并将错误折叠的APP滞留在内质网中，进而促进APP在分泌途径早期在内质网积累（Kudo et al.，2006）。因此，本研究推测，APP/PS1转基因可能会导致APP在内质网中积累并导致ERS。为了验证这一假设，本研究采用免疫荧光染色检测了小鼠海马APP与GRP78的共定位水平和荧光强度。结果发现，APP/PS1转基因小鼠海马组织中APP和GRP78的荧光强度以及APP/GRP78的共定位水平增加。与本研究结果一致，Li等（2019）在APP/PS1小鼠海马组织中观察到APP和GRP78蛋白水平的一致上调。Plácido等（2015）对大鼠脑内皮细胞（RBE4）进行ERS诱导剂处理，发现RBE4中APP和GRP78蛋白水平，以及APP/GRP78共定位水平均提高。这提示，在本研究中，APP/PS1转基因可能增加了APP在小鼠海马内质网中的错误折叠，并导致ERS水平的升高。

研究表明，在转染APP突变的HEK293和COS7细胞中，内质网中APP的滞留与Aβ生成增加有关（Nishitsuji et al.，2009）。这提示，APP/PS1转基因引起的Aβ生成增加可能与APP在内质网中的滞留有关。本课题组前期研究发现，运动可以减少APP/PS1转基因导致的小鼠海马Aβ生成增加（Yu et al.，2021；Zhang et al.，2022）。另有研究发现，游泳运动可以下调Aβ注射诱导的GRP78表达上调（刘涛，2012）。而本研究发现，跑台运动降低了APP/PS1小鼠海马GRP78的表达和APP/GRP78共定位水平，并减少了Aβ斑块水平。这提示，运动可减少APP/PS1小鼠海马Aβ生成，可能与APP在内质网中的积累减少有关。

3.2 跑台运动抑制APP/PS1小鼠海马PERK/eIF2α过度激活和细胞自噬异常

PERK/eIF2α是内质网中缓解ERS的关键信号，然而该信号在AD患者脑内过度激活（Murray et al.，2020）。本研究在APP/PS1小鼠海马中发现p-PERK和p-eIF2α水平增加，这说明PERK/eIF2α通路过度激活与AD的发病机制有关。与本研究一致，Wu等（2021）在APP/PS1小鼠脑内发现PERK/eIF2α信号通路的过度激活。然而，本研究发现跑台运动降低了APP/PS1转基因小鼠海马p-PERK和p-eIF2α 的蛋白水平，提示运动可能抑制了 PERK/eIF2α 信号通路的过度激活。以往研究显示，12周的自主跑轮运动可抑制PS2突变小鼠海马PERK/eIF2α过度激活介导的神经细胞凋亡（Kang et al.，2013）。抑制PERK信号通路还参与了运动对卒中小鼠的神经保护作用（Li et al.，2021）。课题组前期研究显示，跑台运动抑制APP的淀粉样蛋白生 成途径与 PERK/eIF2α 信 号 的下调有关（Xia et al.，2019）。因此，抑制PERK/eIF2α信号通路过度激活可能是运动预防AD的潜在作用途径。

研究发现，PERK/eIF2α信号通路可以调控细胞自噬，PERK/eIF2α的下游分子ATF4和CHOP可介导自噬基因转录，如和（B’Chir et al.，2013）。本研究发现APP/PS1小鼠海马组织PERK/eIF2α信号和表达上调，因此本研究进一步检测了自噬相关基因和的表达。其中，编码的蛋白质Beclin1是自噬的成核因子，调控自噬的启动。ATG7是一种泛素E1样酶，调控ATG5与ATG12的共价结合，三者主要参与自噬体的形成。本研究发现，APP/PS1转基因可以下调小鼠海马组织和的mRNA水平，上调的mRNA水平，说明APP/PS1转基因可能影响了自噬的启动和自噬体的形成。与本研究一致，Panagaki等（2018）发现，APP/PS1小鼠海马 Beclin1和ATG7表达下调；Mohammadi等（2016）在Aβ诱导的AD大鼠海马中发现ATG12的表达升高。和是PERK/eIF2α信号的下游靶分子，本研究发现，伴随着PERK/eIF2α激活，APP/PS1小鼠海马中只有表达上调。因此，表达升高可能是AD病理状态下UPR过度激活的结果。而本研究发现，跑台运动下调APP/PS1小鼠海马PERK/eIF2α信号的同时，却上调了的表达。造成这一结果的原因可能是，跑台运动增强了APP/PS1小鼠海马的自噬活性，提高了自噬效率，因而出现的代偿性升高。为了验证这一假设，本研究进一步检测了自噬效率的变化。结果发现，APP/PS1小鼠海马LC3Ⅱ的蛋白水平升高，P62的蛋白水平降低。值得注意的是，以往研究发现，PERK诱导的eIF2α磷酸化可以导致 ATG12 依赖的 LC3I向 LC3II的转化（Kouroku et al.，2007）。而本研究发现，伴随着PERK/eIF2α信号的激活，APP/PS1小鼠海马LC3Ⅱ表达升高，P62表达下调，说明PERK/eIF2α虽然激活了自噬，但自噬的效率并未提高。这些结果支持了Cai等（2016b）的观点，即AD脑内可能存在过度激活的UPR和无效的细胞自噬。近期研究发现，采用药理学手段下调APP/PS1小鼠皮质UPR后，自噬效率增加（Guo et al.，2018）。药理性下调ERS可以逆转APP/PS1小鼠脑内自噬相关蛋白的表达抑制，进而减少Aβ负荷（Panagaki et al.，2018）。这提示，靶向调节ERS和细胞自噬途径可能有助于缓解Aβ病理。关于运动的研究表明，跑台运动可以提高APP/PS1小鼠海马细胞自噬活性，并降低Aβ水平（Zhao et al.，2018）。本研究发现，跑台运动下调了APP/PS1小鼠海马P62的蛋白水平，说明跑台运动提高了小鼠海马细胞自噬活性。而伴随着细胞自噬活性的提高，跑台运动还下调了PERK/eIF2α信号。这提示，ERS-细胞自噬途径可能参与了AD的运动干预机制。

综上，APP/PS1转基因诱导小鼠海马PERK/eIF2α过度激活，自噬相关基因表达异常，自噬效率降低；而跑台运动可以下调APP/PS1小鼠海马PERK/eIF2α信号，并提高自噬活性，证实了AD海马内存在ERS-细胞自噬途径异常，而运动可改善AD海马ERS-细胞自噬途径的异常。

3.3 跑台运动上调APP/PS1小鼠海马CRT介导的ERS-细胞自噬偶联

以往研究发现，ERS诱导剂可以激活细胞自噬，错误折叠蛋白质聚集可通过PERK/eIF2α通路诱导细胞自噬，内质网Ca失衡也参与诱导细胞自噬（Fedeli et al.，2019；Ogata et al.，2006）。然而，ERS究竟是如何偶联细胞自噬目前尚不完全清楚。本研究发现，在APP/PS1小鼠海马组织中，UPR激活后细胞自噬虽然被启动，但自噬效率并未提高；并且，运动虽然抑制了APP/PS1小鼠海马UPR，但提高了自噬活性。这说明，在AD病理状态下，ERS与细胞自噬之间存在复杂的调控关系。最近研究显示，内质网定位的CRT可偶联ERS和细胞自噬，在ERS状态下，CRT受UPR的诱导表达上调，高表达的CRT通过与LC3结合诱导细胞自噬，从而降解累积的异常折叠蛋白（Yang et al.，2019）。这提示，激活CRT介导的ERS-细胞自噬偶联可能具有缓解AD脑内蛋白质稳态失衡的潜力。

通过生物信息学分析发现，CRT蛋白序列的结合域（Pfam）存在LC3结合区，说明CRT具有介导细胞自噬的潜在可能。基于该生物信息学预测，本研究首先采用Realtime PCR和Simple western技术检测了小鼠海马CRT的表达。结果显示，APP/PS1小鼠海马的mRNA水平和蛋白水平均出现下调，而运动可以上调APP/PS1小鼠海马CRT的蛋白水平。随后，本研究采用免疫荧光技术，检测了CRT与LC3的共定位情况和表达水平，结果发现，APP/PS1转基因并未影响小鼠海马CRT/LC3共定位水平，跑台运动也未引起APP/PS1小鼠海马CRT/LC3共定位水平的变化。但在分子表达水平上，APP/PS1小鼠海马中伴随着LC3表达上调，CRT表达出现下调。运动虽没有影响APP/PS1小鼠海马LC3的表达，但上调了CRT的表达。因此，本研究推测，在PERK/eIF2α过度激活状态下，APP/PS1小鼠海马自噬活性降低可能与CRT的表达下调有关。而在运动干预下，APP/PS1小鼠海马自噬活性增加可能与CRT的水平上调有关。支持这一推测的证据如下：1）生物信息学预测，CRT可能介导细胞自噬；2）Yang等（2019）通过免疫共沉淀实验确定了CRT与LC3相互作用的位点，并在诱导ERS的条件下发现CRT与LC3的相互作用增强，在Yang等（2019）的研究中，过表达CRT可促进使细胞自噬水平并缓解ERS，而敲减CRT则导致ERS条件下自噬受损；3）AD患者脑内存在自噬异常也存在CRT表达下调（Hubbard et al.，2022；Taguchi et al.，2000），而本研究发现运动可以上调CRT的表达并提高自噬活性。综上，CRT可能是运动提高细胞自噬的效应因子，其可能通过介导ERS-细胞自噬偶联，促进AD脑内错误折叠蛋白质清除。

4 结论

和突变可能破环内质网功能，增加APP错误折叠和Aβ聚集，诱发ERS并导致PERK/eIF2α过度激活，从而降低自噬效率，抑制AD脑内异常蛋白质的清除。跑台运动可以预防和基因突变导致的AD病理，其生物学机制可能与ERS-细胞自噬偶联有关（图6），即跑台运动可以降低Aβ斑块水平，减少APP在内质网中积累，缓解ERS并抑制PERK/eIF2α过度激活，进而提高细胞自噬活性并上调CRT介导的ERS-细胞自噬偶联，从而有益于减少AD脑内错误折叠蛋白质的生成和聚集。

图6 运动调控ERS-细胞自噬偶联缓解AD病理的可能机制Figure 6.Possible Mechanism of Exercise Alleviating AD Pathology by Regulating ERS-autophagy Coupling