基于LED的便携式牛乳亚硝酸盐含量检测仪研究

郭文川 李思睿 杨 烨 董一鸣 张毛赛 朱新华

(1.西北农林科技大学机械与电子工程学院， 陕西杨凌 712100；2.农业农村部农业物联网重点实验室， 陕西杨凌 712100)

0 引言

牛乳富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质和维生素等多种营养成分，是人们摄取营养物质的重要来源[1]。为了防止牛乳变质，一些牛乳生产者常给牛乳中添加一定量的亚硝酸盐。长期或过量食用亚硝酸盐食品，会导致人体急性中毒、致癌，甚至死亡[2]。因此，我国农业行业标准[3]已经将亚硝酸盐含量作为乳及乳制品的常规检测项目之一，且规定液态乳中亚硝酸盐质量浓度(以NaNO2计)不超过0.2 mg/L。

文献[4]规定检测乳品中亚硝酸盐含量的方法有离子色谱法和分光光度法。冯伟科等[5]和颜琪等[6]利用离子色谱法测量了牛乳及其制品中的亚硝酸盐含量，其检测限分别为0.02 mg/kg和0.04 mg/kg。肖琴等[7]和苗攀登等[8]基于分光光度法测定了牛乳中的亚硝酸盐含量，其检测限分别为0.009 0 mg/L和76.43 ng/mL。这些结果说明，国家标准规定的方法在检测亚硝酸盐含量方面具有检测灵敏度高、误差小的优点，但其样品前处理过程复杂、操作耗时，且所需仪器价格昂贵，尤其是离子色谱法，难以广泛适应于现场检测。

国内外学者也采用气相色谱法[9]、高效液相色谱法[10-11]、荧光法[12-14]、化学发光法[15]、电化学法[16-18]、毛细管电泳法[19]等定量测定乳品中的亚硝酸盐含量，虽取得了较好的研究成果，但气相色谱法、高效液相色谱法、荧光法、化学发光法和毛细管电泳法仍存在着仪器体积大并且价格昂贵、前期样品处理过程繁琐、后期数据处理过程复杂等缺点；电化学检测方法又存在传感器的制备较为复杂、仪器昂贵的缺点。所以这些检测方法不便于普及应用。因此，研发一种成本低、响应快且便于携带的牛乳中亚硝酸盐含量检测装置对于保障乳品品质安全具有重要意义。

亚硝酸盐在弱酸条件下会与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，再与盐酸萘乙二胺偶合后会形成紫红色的偶氮化合物，且其显色的程度与亚硝酸盐的含量密切相关。基于此原理，本文设计一种便携式牛乳中亚硝酸盐含量检测仪，并对检测仪的性能进行验证。

1 材料与方法

1.1 试验样品及制备方法

为了保证所用样品具有良好的代表性，选择以蛋白质质量浓度为3.2 g/mL的全脂灭菌乳(伊利牌)作为研究对象。所用样品均购于当地超市。

采用NaNO2作为亚硝酸盐，向97.5 mL的牛乳中加入2.5 mL质量浓度为200 mg/L的NaNO2溶液。混合均匀后，以0.08 mL的间隔移取混合液0～2 mL，随后加牛乳定容至10 mL，并分4批制备得到亚硝酸盐质量浓度为0～1 mg/L，间隔为0.04 mg/L的牛乳样品共104份，定义为A批。按照上述的方法，制备亚硝酸盐质量浓度为0～0.78 mg/L，间隔为0.02 mg/L的牛乳样品160份(B批)，同时另配制亚硝酸盐含量在此浓度范围内随机分布的牛乳样品20份(C批)。其中，A批样品用于提取检测牛乳中亚硝酸盐含量的特征波长，B批样品用于建立和评估亚硝酸盐含量定量检测模型的性能，而C批样品用于测试所开发检测仪的性能。

每个样品中首先加入2 mL质量浓度为4 g/L的对氨基苯磺酸盐酸溶液，混匀后静置3 min，然后再加入1 mL质量浓度为2 g/L的盐酸萘乙二胺水溶液，混匀后静置20 min进行试验。整个试验在室温((23±1)℃)下进行。

1.2 特征波长提取

1.2.1可见漫反射光谱采集和光谱预处理

将A批中的每个样品置于一平底的石英杯后，利用微型光谱仪(USB4000型，Ocean Optics公司，美国)采集A批各样品的可见漫反射光谱。光谱扫描范围380～780 nm，扫描3次，平滑度100；以在250～2 000 nm波长范围内具有99%反射率的聚四氟乙烯的可见漫反射光谱作为参比光谱[20]。试验过程中杯底至探头的距离为7 mm。每个样品重复测量3次，以3次重复的平均值作为测量结果。

由于仪器内部或测量环境因素的变化导致光谱仪在采集目标参数时存在噪声，因此在建模前常需要对光谱进行预处理[21]。Savizky-Golay (SG)平滑算法是一种常用的光谱预处理方法，它是根据选定窗口的大小，在使窗口移动的过程中，对其内部光谱变量进行最小二乘拟合分析，从而达到去噪的目的。

1.2.2样本划分

将A批样品中前3批样本作为校正集，最后1批样本作为预测集，即校正集与预测集比例为3∶1。

1.2.3特征波长选择

提取特征波长是设计基于多光谱技术的便携式检测仪的先决条件[22]。本研究选择常用的连续投影算法(Successive projections algorithm, SPA)提取特征波长。根据向量的投影分析，SPA从A批校正集内筛选出具有低冗余信息的光谱变量。由最小的校正均方根误差(Root mean square error of calibration，RMSEC)确定最佳特征波长。SPA能最大限度降低光谱数据间的共线性，从而使建立的模型更为简便、高效。

1.3 检测仪硬件系统设计

图1所示是检测仪硬件系统示意图。该检测仪的硬件系统主要由微控制器模块、光源模块、光传感器模块、电源和输入输出模块组成。微控制器模块负责控制外围设备，实现数据的采集与处理；光源模块负责输出光强稳定的特征波长；光传感器模块采集漫反射光信号，并将转换后的数字信号传输至微控制器；输入输出模块负责输入工作指令，指引用户完成操作并将检测结果反馈至显示屏；电源采用锂电池，为系统各硬件提供稳定的电压输入。

1.3.1微控制器模块

微控制器模块由时钟电路、复位电路、电源管理电路和降压电路组成。本文以STC12C5A60S2为微控制器，时钟采用11.059 2 MHz的石英晶振，复位电路使用按键复位方式。

以IP5306芯片管理电源。该芯片具有充放电一体、升压转换和电量指示的功能，其电路如图2所示。在本设计中，IP5306的充电输入端VIN与TYPE-C接口相连，可以为电源直接供电。升压输入端BAT与电源正极相连，输出端VOUT负责向STC12C5A60S2芯片提供5 V的工作电压。发光二极管(Light-emitting diode，LED)驱动端用来驱动5个LED，以便根据灯显模式判断电源的充放电状态。结合按键输入端KEY处的按键控制，整体电量显示和升压输出可通过操作键操作实现。

图1 检测仪硬件系统示意图Fig.1 Schematic of hardware system of detector

图2 电源管理电路Fig.2 Power management circuit

在向微控制器的外围设备提供电源输出的前提下，使用AMS117芯片设计了一个5 V转3.3 V的降压电路，如图3所示。该电路输入端VIN和输出端VOUT均并联有100 nF和10 μF的电容，其作用是滤除直流电路中的高频和低频干扰信号。

图3 降压电路Fig.3 Buck circuit

1.3.2光源模块

综合比较不同类型光源的光强、功耗和体积等，选择以LED作为光源。结合1.2节确定的特征波长，选择469、500、546、628、665 nm的LED作为检测光源，各LED的工作电流为100 mA。LED驱动电路由驱动器QX7136和采样电阻组成，如图4所示。将5 V作为QX7136的电源电压，则LED电流ILED与RCS的关系为

(1)

式中ILED——LED电流，mA

VCS——采样电压，取50 mV

RCS——采样电阻，Ω

根据LED工作电流可计算出RCS，本文取0.5 Ω。由于处理器需依次控制多个LED的恒流导通，因此将经采样电阻后的电流设定脚CS与芯片地引脚GND同时连至微控制器Px口，进行高电平和低电平的转换。

1.3.3光传感器模块

考虑到成本和精度的需求，选择GY-30型数字光照传感器检测经牛乳样品漫反射后的光照强度。该传感器的光响应范围为400～700 nm，内置16位A/D转换器，输入电压为3～5 V，可通过I2C协议实现与微控制器的通信[23]。

1.3.4电源和输入/输出模块

以604060型锂电池作为该检测仪的移动电源，容量为2 200 mA·h，供电电压为3.7～4.2 V。本检测仪设计了4个按键用于控制检测仪电源的通断、检测电路的启动、仪器校准和样品检测等功能。显示器件为OLED 12864显示屏，其与微控制器之间采用I2C协议通信。

1.4 检测仪软件设计

在Keil μVision4开发软件环境中采用C51语言编写检测仪的软件。该软件主要包括主函数、按键子函数、光照度采集子函数、数据处理子函数以及显示子函数等。主函数用于完成元器件的初始化和各子函数的协调运行；按键子函数根据用户操作完成各模块的功能调用；光照度采集子函数用于实现漫反射光照度的采集和数据的传输控制；数据处理子函数负责实现漫反射率的计算，以得到牛乳中亚硝酸盐含量的测定值；显示子函数实现将仪器的检测结果输出到显示屏。

1.5 建模方法及评价指标

偏最小二乘回归(Partial least squares regression, PLSR)是一种线性校正方法。该方法是在分解光谱矩阵X和浓度矩阵Y的基础上，结合迭代分析确定隐变量集合，并利用它对Y实施线性回归，从而求取X与Y的关联预测模型的过程。PLSR可以有效避免变量多和样本数少的问题，满足单组分定量分析的可靠性需求。

本研究采用校正相关系数RC、校正均方根误差(RMSEC)、预测相关系数RP、预测均方根误差(RMSEP)及预测偏差比率(RPD)作为评估PLSR模型性能的指标。

2 结果与讨论

2.1 特征波长确定

2.1.1光谱分析

图5所示是经SG预处理后的A批104份牛乳样本的漫反射光谱。由图5可知，在380～780 nm的可见光谱范围内，各样品的漫反射率随波长的变化规律基本一致。在460～660 nm之间，牛乳样品出现吸收峰或反射峰，且随着牛乳中亚硝酸盐含量的增大，吸收峰更加突出。这说明，随着亚硝酸盐含量的增大，牛乳中的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸盐酸溶液和盐酸萘乙二胺水溶液反应后的颜色更加明显。

图5 经SG预处理后牛乳样本的可见漫反射光谱Fig.5 Visible diffuse reflectance spectra of milk samples after SG pretreatment

2.1.2特征波长提取

按3∶1的比例对A批中的牛乳样品进行样本划分，则校正集中有78份样品，预测集中有26份样品。对校正集中的78份样品应用SPA法提取对亚硝酸盐含量的敏感特征波长。在提取特征波长时，将特征波长数的范围设定为1～11，间隔为1，计算每个特征波长下的RMSEC，结果如图6所示。由图6可见，当特征波长数为10时，RMSEC达到最小值0.047 60 mg/L。少的波长数有助于降低仪器成本并减小仪器体积。由于波长数为8时的RMSEC与最小的RMSEC在0.05 mg/L的水平上没有显著差异，因此，将特征波长数确定为8。此时，所确定的特征波长为492.13、456.49、553.02、627.60、412.51、433.10、402.60、668.75 nm。

基于A批样品的校正集所提取的特征波长建立预测A批牛乳样品中亚硝酸盐含量的PLSR模型，结果表明，RC和RMSEC分别为0.990和0.043 mg/L，RP和RMSEP分别为0.986和0.052 mg/L，RPD为5.838。可见，基于SPA法提取特征波长所建立的PLSR模型能够很好地预测牛乳样品中的亚硝酸盐含量。

图6 基于SPA提取的不同特征波长数计算的RMSECFig.6 Calculated RMSEC at different numbers of characteristic wavelengths selected by SPA

2.1.3检测波长确定

由于实际LED都有一定的响应范围，综合考虑市场上LED的规格参数以及选择的特征波长，最终确定以中心波长为469、500、546、628、665 nm的LED作为检测光源。图7为用USB4000微型光谱仪测量得到的5个LED的光响应谱。由图7可知，每个LED都有良好的光响应特性。

图7 所选择LED灯的光响应谱Fig.7 Optical response spectra of selected LEDs

2.2 检测仪设计

图8a为所设计的牛乳中亚硝酸盐含量检测仪的原型机，其外壳采用3D打印技术制作。该仪器的尺寸为120 mm×90 mm×80 mm，总质量为340 g。为避免外部环境光干扰和内部光的泄漏，仪器顶部另置有遮光盖。

图8b为样品池、光源和光传感器的位置关系。其中样品池为石英杯，5个LED均匀分布在石英杯的底部，且与水平方向呈45°夹角。

图8 牛乳中亚硝酸盐含量检测仪的样机以及样品 池、光源和光传感器的位置关系Fig.8 Prototype of nitrite content detector for milk and positions of sample cell, light source and light sensor 1、9.支撑座 2.样品池 3.遮光盖 4.显示屏 5.电源键 6.启动键 7.校准键 8.检测键 10.石英杯 11.牛乳样本 12.LED 13.光传感器 14.托台

为了克服外界环境对检测结果的影响，在使用前以聚四氟乙烯作为参考白板对该检测仪进行校正。测量时，首先依次按下电源键和启动键，然后将参考白板放在传感器顶部。接着按校准键，采集并保存传感器所获取的各个波长下白板的漫反射光照度IWi。随后，向样品池加入配制好的牛乳样本，并将样品池放于光源上部的测试位置。用遮光盖盖住样品池，然后按下检测键，记录传感器在各个波长下感知的牛乳样本的漫反射光照度ISi。每份样本重复测量3次，3次测量平均值作为该样本的最终检测结果。根据求样品在各个波长下的漫反射率Ri，进而得到该样品的漫反射多光谱R。式中i取1～5分别对应波长469、500、546、628、665 nm。

(2)

2.3 建模结果

利用检测仪采集B批160个牛乳样品的漫反射多光谱，将样本按3∶1的比例划分为校正集和预测集后，采用PLSR建立预测牛乳中亚硝酸盐含量模型。在求得的建模结果中，RC和RMSEC分别为0.981和0.045 mg/L，RP和RMSEP分别为0.992和0.033 mg/L，而RPD为7.104，说明模型具有良好的定量预测能力。所构建的牛乳中亚硝酸盐含量的PLSR模型为

y=0.099 4R1-1.408 9R2-2.422 5R3+ 1.280 5R4+1.695 5R5+0.566 8

(3)

式中y——亚硝酸盐质量浓度，mg/L

基于所建立的PLSR模型编写数据处理子函数，使得检测仪能够根据所获得的漫反射率计算出牛乳中的亚硝酸盐含量。

2.4 仪器稳定性测量

2.4.1漫反射率测量稳定性

为了验证本检测仪在测定样本漫反射率过程中的稳定性，从C批样品中任取亚硝酸盐含量不同的牛乳样本5份，对每个样本重复测量10次，测量结果的变异系数如表1所示。由表1可知，各样本的变异系数不大于1.35%，说明本检测仪具有良好的稳定性。

表1 多次测量下不同亚硝酸盐含量牛乳样品漫 反射率的变异系数Tab.1 Coefficient of variation of diffuse reflectance of milk samples at different nitrite contents under multiple measurements

2.4.2亚硝酸盐含量测量稳定性

另从C批中任取5份亚硝酸盐含量不同的牛乳样本，用于检验该检测仪对亚硝酸盐含量测量结果的稳定性。结果表明，牛乳样本在10次测量中，随着亚硝酸盐含量的增大，变异系数迅速减小，对于任取的5份样本，测量结果的变异系数范围为0.63%～14.64%，平均值为4.26%。对于农业行业标准规定的0.2 mg/L最大允许残留量下，此时变异系数为1.75%，说明仪器能够稳定地检测亚硝酸盐含量。

2.5 亚硝酸盐含量检测精度验证

利用C批配制的亚硝酸盐质量浓度在0～0.78 mg/L范围内的20份样本对所设计的便携式牛乳中亚硝酸盐含量检测仪的精度进行验证，验证结果如图9所示。由图9可知，测量结果紧密分布在45°线周围，可见本仪器的亚硝酸盐含量测定值与亚硝酸盐含量实际值基本一致。

与亚硝酸盐质量浓度实际值相比，该检测仪绝对测量误差为-0.13～0.07 mg/L，平均绝对误差为0.03 mg/L。这说明本检测仪能够精确地检测牛乳中的亚硝酸盐含量。另外，对20份样品检测时间的统计结果表明，从按下“检测”键到给出测量结果所用时间小于3 s。

图9 亚硝酸盐质量浓度仪器测定值与实际值比较Fig.9 Comparison of actual values of nitrite mass concentration with instrumental measurements

3 结论

(1) 基于亚硝酸盐与对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺反应变色的原理，设计了一种由微控制器模块、光源模块、光传感器模块、电源和输入输出模块等硬件系统组成的便携式亚硝酸盐含量检测仪。采用C51语言编写检测软件。

(2) 利用SPA算法从380～780 nm的波长范围内提取了对牛乳中亚硝酸盐含量敏感的8个特征波长。综合考虑成本、LED光谱响应范围等，确定了以中心波长为469、500、546、628、665 nm的5个LED为检测光源。

(3) 在0～0.78 mg/L的亚硝酸盐质量浓度范围内，该检测仪检测牛乳中亚硝酸盐质量浓度绝对误差为-0.13～0.07 mg/L，平均绝对误差为0.03 mg/L。