基于网络药理学和实验验证探讨淫羊藿苷经MAPK信号通路防治激素性股骨头坏死的作用机制

王志洲，邹德宝，石 威,，姜红江,*

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230000；2.山东省文登整骨医 院，山东 威海264400）

激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH）是由于长期或大剂量服用激素使血管胶原纤维和弹性纤维功能障碍，股骨头内微小动脉栓塞引起股骨头发生局部或完全性的缺血，从而导致股骨头坏死，是骨科临床最常见的疑难疾病，其主要表现为髋部疼痛和髋关节内旋功能障碍[1-2]。 流行病学调查显示，该病常见于30～50 岁的中青年男性人群，超一半以上的患者发病累及双侧[3]，已占据非创伤性股骨头坏死总发病的近60%[4]， 且近年来发病率呈逐年升高的趋势，每年新增约15～20 万病例[5-6]。 股骨头坏死范围广，且进展不可逆，致残率极高，已经严重危害患者的生命健康以及降低患者的生活质量[7]。现今，对于SANFH的治疗通常使用降脂、抗凝药，其毒副作用大且疗效不明显， 所以需要迫切寻求更有效的防治方法。中医药具有几千年的历史文明， 其治疗股骨头坏死源来已久，具备完善的理论、丰富的临床经验和独特的优势，可作为防治股骨头坏死的首选方法。淫羊藿苷（icariin, ICA）是中药淫羊藿的一种提取成分，有补肾、抗衰老的作用[8-9]。 现代药理研究证实，ICA 具备优良的促进成骨的功效， 但其治疗SANFH 的作用机制尚不明确，此次实验基于网络药理学和动物实验验证的方法进一步探讨ICA 防治SANFH 的机制，以期为后续研究提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

8 周龄SPF 级雄性SD 大鼠共24 只，体质量270～310 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）20190003。动物饲养于山东省文登整骨医院骨伤组织工程实验室（三级），笼温控制在（20±2） ℃，相对湿度45%～55%。本次实验动物研究通过山东省文登整骨医院医学伦理委员会批准（伦理审批编号：LL2022011501）。

1.2 实验仪器

电子天平（型号：A2013，上海民桥精密科学仪器有限公司）;双通道流量计（型号：MS-2，上海玉研科学仪器有限公司）；Micro-CT（型号：NMC-100，昆山平生医疗科技有限公司）；-80 ℃冰箱（型号：DW-86L338J，青岛海尔生物医疗股份有限公司）；Western blot 系统（型号：VE-586，上海天能科技有限公司）；高速离心机（型号：Micro21R，赛默飞世尔科技公司）。

1.3 实验药物与试剂

ICA（批号：115H021，北京索莱宝科技有限公司）；脂多糖（批号：012021210430，北京碧云天生物技术有限公司）；甲泼尼龙（批号：20110408，国药集团容生制药有限公司）；青霉素钠（批号：43201105，山东鲁抗医药股份有限公司）；苯巴比妥钠（批号：2103071，天津金耀生物科技有限公司）；异氟烷（批号：202106，北京科月华诚科技有限公司）；牛血清白蛋白、5%脱脂奶粉、RIPA 裂解液、PMSF、一抗/二抗稀释液、PVDF 膜、TBST 溶液、特超敏ECL 试剂盒、p-ERK1 抗体、p-p38 抗体、p-JNK 抗体、GAPDH 抗体（北京碧云天生物技术有限公司，批号分别为ST025、P0216、P0013C、ST505、P0023A/P0023D、FFP26、P0231、P0018AS、AF1891、AF5884、AF5860、AF0006）。

2 方法

2.1 ICA 潜在靶点预测

通过TCMSP 数据库[10]查询ICA 的ADME 属性值和CAS 号，从PubChem 数据库[11]获得ICA 2D 结构用于PharmMapper 数据库[12]潜在靶点的预测，根据Norm Fit[12]进行潜在靶点筛选，完成后利用UniProt数据库对蛋白质靶点进行标准化。

2.2 SANFH 相关靶点获取

以“steroid -induced avascular necrosis of the femoral head”为主题词，检索OMIM 数据库[13]、Gene-Cards 数据库[14]、DisGeNET 数据库[15]中SANFH 的相关靶点，合并3 个数据库靶点，去重后得到SANFH的相关靶点。

2.3 PPI 网络构建

为明确ICA 潜在靶点与SANFH 相关靶点之间的关系，将两者靶点导入Venny 平台制作韦恩图。然后将共同靶点输入STRING 数据库[16]构建PPI 网络模型，最小相互作用值设置为“medium confidence（0.400）”，隐藏网络中断开连接的节点，得到PPI 网络，并通过Cytoscape 3.9.1[17]对PPI 网络进一步分析，并构建ICA-SANFH 靶点的可视化网络图。

2.4 ICA 防治SANFH 相关靶点GO、KEGG 富集分析

将ICA 防治SANFH 的共同靶点录入DAVID数据库，根据count 值选用排名前10 位、前20 位数据导入微生信云平台绘制GO 富集分析条形图、KEGG 通路富集分析气泡图。 为更加直观地显示ICA 防治SANFH 所涉及KEGG 通路的相关靶点，运用Cytoscape 3.9.1 构建“靶点-信号通路”网络图。

2.5 实验分组、造模与灌胃方法

24 只雄性SD 大鼠按随机数字表法分成空白组（n=8）、模型组（n=8）、ICA 组（n=8）。 取模型组、ICA组共16 只大鼠造模，造模方法参照文献[18]并进行适当改进。 造模组按2 mg·kg-1·d-1确定每只大鼠注射LPS 剂量。第3 天开始，造模大鼠臀肌交替注射甲泼尼龙40 mg·kg-1·d-1，连续10 d。 在注射甲泼尼龙后予腹腔注射青霉素钠80 U·d-1以预防感染。 造模成功后普食饲养7 d，空白组、模型组均使用生理盐水5 mL 灌胃，ICA 组按照实验动物用药换算法计算给药剂量，将ICA 用生理盐水配成5 mL 药液进行灌胃，连续8 周。 所有实验动物在相同条件下喂养，用悬吊法饮水使其下肢直立行走。 8 周后腹腔注射苯巴比妥钠处死实验动物，在清洁条件下剖开双侧股骨头，剔除周围软组织后置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.6 Micro-CT 定量分析股骨头骨参数

在灌胃8 周后，腹腔注射相应浓度的苯巴比妥钠深度麻醉所有实验动物，在清洁条件下剖开双侧股骨头， 使用Micro-CT 对大鼠股骨头进行扫描定量，分析骨小梁参数如骨矿物质密度（bone mineral density, BMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number, Tb.N）和骨小梁分离度（trabecular spacing, Tb.Sp）4 个指标。

2.7 Western blot 检测相关蛋白的表达

将大鼠股骨头剪碎，与RIPA 裂解液、PMSF 进行混合后加入到离心管中，充分研磨并碾碎，再使用组织匀浆机充分裂解，结束后4 ℃离心10 min，取上清装至离心管中以待检测。使用BCA 蛋白质定量试剂盒测定蛋白含量。取适量上清，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。 加入一抗（p-ERK1 按1∶2000 稀释、p-p38 按1∶1000 稀 释、p-JNK 按1∶1000 稀 释，GAPDH 按1∶5000 稀释），4 ℃孵育过夜。 洗膜后加入二抗，室温孵育2 h。TBST 溶液洗3 遍，使用ECL试剂盒进行显影。以GAPDH 为内参，计算各蛋白相对表达量。

2.8 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件对本次实验所有数据进行统计分析，计量资料使用“±s”的形式表示，符合正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析。 取显著性水平α=0.05，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ICA 靶点的筛选

通过TCMSP 数据库查询到ICA 的CAS 号为489-32-7，OB 值为41.58%，DL 值为0.61，符合筛选原则[19]。 PharmMapper 数据库初步提取前300 位的靶点，对根据Norm Fit≥0.5 筛选得到的靶点进行标准化，去重后得到预测靶点226 个，排名前50 位的预测靶点见表1。

表1 ICA 的预测靶点

3.2 SANFH 相关靶点的获取

从OMIM、GeneCards、DisGeNET 数据库中分别获得SANFH 相关靶点84 个、571 个、74 个，合并3个数据库的相关靶点后除去重复值，最终得到677个SANFH 相关靶点。

3.3 PPI 网络的构建

将筛选出来的ICA 靶点与SANFH 靶点取交集，并通过Venny 平台制作韦恩图，得到ICASANFH 共同靶点53 个，见图1。 进而将共同靶点输入STRING 平台，得到ICA-SANFH 靶点PPI 网络，排除1 个游离的靶点蛋白（无相互作用蛋白），见图2。 为了进一步筛选出有较多交互关系的靶点，利用Cytoscape 平台，根据Degree>30 筛选出更为重要的共同靶点聚类，见图3。

图1 ICA-SANFH 靶点韦恩图

图2 ICA-SANFH 靶点PPI 网络图

图3 共同靶点聚类

3.4 GO、KEGG 富集分析

将53 个共同靶点导入DAVID 数据库进行GO富集分析，根据count 值分别选取排名前10 位的靶点运用微生信平台对结果进行可视化，见图4。 由结果可见ICA 参与的重要生物进程包含凋亡过程的负调节、细胞增殖的正向调控和信号转导等，在细胞组分中主要作用于细胞外隙、细胞质和胞质溶胶等，调节SANFH 的功能主要富集于蛋白结合、相同的蛋白结合和ATP 结合等。 根据count 值选用KEGG通路结果中排名前20 位的通路绘制成气泡图，见图5。KEGG 富集通路提示ICA 可以通过癌症、MAPK、PI3K-Akt 等信号通路和MAPK8、MAPK10、MAPK14、AKT1、EGFR 等主要靶点参与调控SANFH。 为了更加直观地显示ICA 治疗SANFH 的KEGG 通路所涉及的相关靶点，使用Cytoscape 软件构建的“靶点-信号通路”网络图共有56 个节点，213 条边，见图6。从图中可知，每条通路可能富集到多个靶点基因，而一个靶点基因同时又出现在多条KEGG 通路中。

图4 ICA 治疗SANFH 靶点GO 富集分析条形图

图5 ICA 治疗SANFH 靶点KEGG 通路富集分析气泡图

图6 ICA 治疗SANFH“靶点-信号通路”网络图

3.5 Micro-CT 扫描骨参数结果

Micro-CT 扫描结果显示：空白组大鼠股骨头骨小梁结构致密有规则，未见坏死征象；模型组大鼠股骨头明显骨质疏松，骨小梁变细、断裂，骨小梁间隙明显增宽，提示有明显骨坏死征象；相比于模型组，ICA 组大鼠股骨头骨小梁结构增多，间隙有改善，稍有骨小梁变细、断裂迹象，骨坏死范围明显减少，见图7。 Micro-CT 扫描结果显示：相比于空白组，模型组和ICA 组的BMD、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 指标差异均具有统计学意义（P＜0.05）；相比于模型组，ICA 组的BMD、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 指标差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 详见表2。

图7 Micro-CT 扫描的大鼠股骨头征象

表2 Micro-CT 骨参数比较（n=8，±s）

表2 Micro-CT 骨参数比较（n=8，±s）

注：与空白组相比，△P＜0.01；与模型组相比，▲▲P＜0.01。

指标BMD Tb.Th Tb.N Tb.Sp空白组0.909±0.029 0.649±0.035 6.113±0.211 0.055±0.005模型组0.674±0.044△0.377±0.033△3.146±0.198△0.146±0.015△ICA 组0.741±0.035▲▲0.512±0.033▲▲3.946±0.226▲▲0.105±0.006▲▲

3.6 Western blot 检测p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表达结果

3 组大鼠骨组织内p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表达情况见图8。根据表3 可知，相比于空白组，模型组p-ERK1 蛋白明显降低（P＜0.05），p-p38、p-JNK蛋白明显增加（P＜0.05）；相比于模型组，ICA 组p-ERK1 蛋白明显升高（P＜0.05），p-p38 蛋白降低（P＜0.05），p-JNK 蛋白明显降低（P＜0.05）。

表3 3 组p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表达比较（n=8，±s）

表3 3 组p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白表达比较（n=8，±s）

注：与空白组相比，△P＜0.01；与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

ICA 组0.699±0.034▲▲0.98±0.045▲0.99±0.068▲▲指标p-ERK1 p-p38 p-JNK空白组0.959±0.037 0.848±0.037 0.824±0.018模型组0.563±0.04△1.086±0.088△1.159±0.07△

图8 大鼠股骨头p-ERK1、p-p38、p-JNK 蛋白的表达情况

4 讨论

在中医学中，根据股骨头坏死的临床症状、发病特点，结合中医古籍论述，早期股骨头坏死归属于 “骨痹”“痹证”， 进一步缺血性坏死则归类为“骨痿”“骨蚀”的范畴[20]。 《素问·长刺节论篇》[21]有骨痹的记载。 《脾胃论》认为肾藏精，主骨，生髓，髓养骨，骨枯髓减，发为骨蚀。 《素问》就有“肾主身之骨髓……发为骨痿之症”的记载。 从发病形态、致病机制、临床症状上看，可认为股骨头坏死属于中医学中的“骨蚀”“骨痿”“骨痹”。 其病机主要为肾虚和血瘀。 治疗上以补肝肾、强筋骨、祛瘀生新为主。

由于ICA 可能通过不同的靶点和信号通路对SANFH 进行调节，因此借助网络药理学的手段加以预测分析。 本次PPI 网络分析结果得到的核心靶点有ALB、AKT1、MAPK9、IGF1、EGFR 等，表明ICA防治SANFH 具有多靶点的特征。 SANFH 的发病首先侵犯的是软骨，参与关节软骨细胞增殖、分化的信号通路对于治疗SANFH 至关重要。KEGG 通路富集分析结果显示，ICA 治疗SANFH 涉及的主要信号通路有癌症、MAPK、PI3K-Akt 通路等。 （1）癌症通路：包含了诸多通路如Wnt 信号通路、Hedgehog信号通路、Notch 信号通路等多个下游通路[22]，比较复杂。其中，Wnt 蛋白是一组分泌型糖蛋白，是促进成骨细胞分化和活性的重要调节因子[23]。 （2）MAPK 信号通路：该通路属于关节软骨损伤的重要信号传导通路[24]，能够影响成骨细胞的分化和凋亡[25]。 （3）PI3K-Akt 信号通路：该通路属于调节自噬的经典通路，参与调节关节软骨细胞的平衡[26]，已被证实与血管修复再生、成骨细胞和破骨细胞分化密切相关[27]。 由此预测，ICA 可通过ALB、AKT1、MAPK9、IGF1、EGFR 等靶点作用于癌症、MAPK、PI3K-Akt 等通路调控SANFH 的发生。

为进一步研究网络药理学预测的科学意义，对MAPK 通路的靶点进行验证，采用甲泼尼龙联合LPS 的方式诱导SANFH 大鼠模型，并予以ICA 灌胃处理。 动物药理实验结果显示：与空白组相比，模型组大鼠BMD、Tb.Th、Tb.N 和Tb.Sp 指标差异均具有统计学意义(P＜0.05)，p-ERK1 蛋白表达显著降低(P＜0.05)，p-p38 蛋白和p-JNK 蛋白显著升高(P＜0.05)；与模型组相比，ICA 组大鼠BMD、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp 均具有统计学意义(P＜0.05)，p-ERK1 蛋白表达显著升高(P＜0.05)，p-p38 蛋白和p-JNK 蛋白显著降低(P＜0.05)。 既往研究发现，ICA 具有改善骨代谢和增强骨密度与强度的作用[28]，同时ICA 可作为细胞外因素刺激MAPK 信号通路进行成骨分化[29]。MAPK 家族主要包括ERK、p38、JNK。 WAN 等[30]研究证实ERK 的激活或抑制可以调控成骨分化。在成骨分化过程中，调控p38 相关通路有助于促进成骨细胞功能表达和体内骨矿化[31]。 JNK 相关通路与ERK 和p38 通路存在相互作用和密切联系，是机体细胞代谢过程中重要的调节点，在成骨细胞分化中发挥着重要作用[32]。 YOON 等[33]研究发现JNK 相关通路是软骨细胞代谢过程中重要的调控环节。 结合实验结果说明，ICA 能够提高骨密度，同时具有促进成骨细胞生成，从而对SANFH 发挥治疗作用，证明了ICA 对MAPK 通路是存在作用的。

综上所述，本次研究采用网络药理学结合动物药理实验的方法证实了ICA 经MAPK 信号通路治疗SANFH 的作用机制，具有一定的应用价值，且课题组将在后续研究中会使用不同浓度的ICA，深入研究其治疗SANFH 的作用机制，从而更好地为药物的研发提供新思路。