按法干预心俞穴对心肌缺血大鼠心肌保护作用的研究

吴 琼，谢宗池，黄 河，李 甜，朱晓晴，李 武*，李铁浪*（湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

缺血性心脏病（ischemic heart disease, IHD），也被称为冠心病（coronary heart disease, CHD），是由冠状动脉粥样硬化引起血管狭窄，引发心肌缺血缺氧甚至坏死的一种综合征，属中医学“胸痹”“心痛”的范畴[1]。 《针灸大成·卷五》曰：“心内怔忡，心俞、内关、神门。”心俞穴是临床上治疗胸痹心痛的常用穴位之一[2-4]。 《素问·举痛论》中有“寒气客于背俞之脉则脉泣，脉泣则血虚，血虚则痛，其俞注于心，故相引而痛，按之则热气至，热气至则痛止矣”的记录，其中，“按之则热气至，热气至则痛止矣”阐释了按法治疗胸痹心痛等痛症的作用机制[5]。 有研究发现，按法的机械刺激、热传递与穴位深部的热源物质有关，机械刺激激发机体处于高能代谢状态，使局部温度升高，产生“热气至”效应，从而改善血液循环，发挥散寒通络止痛的作用[6]，是针对胸痹“阴寒内盛，胸阳痹阻”病机的治疗关键[7]。 生理情况下，心肌细胞能量供需处于动态平衡，但是在强烈应激和缺血缺氧时，心脏能量供需失衡，影响心脏正常生理功能[8]，因此，改善心肌能量供需平衡有利于恢复心脏正常功能。基于以上科学事实，本团队欲探索按法干预心俞穴发挥心肌保护效应的机制及其与心肌能量代谢的关系，故本实验采用急性心肌缺血模型，通过按法干预心俞穴观察心肌损伤指标和能量代谢产物含量变化，探讨按法干预心俞穴对心肌缺血的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

36 只健康雄性成年SD 大鼠（SPF 级），由湖南中医药大学动物实验中心提供，体质量250～280 g，分笼饲养于湖南中医药大学动物中心实验室，饲养温度24～26 ℃，湿度50%～70%。

将36 只动物随机分为假手术组、模型组、按法组3 组，每组12 只。 假手术组开胸后冠状动脉只扎不结；模型组、按法组采用冠状动脉左前降支结扎术建立大鼠心肌缺血模型[9]。 按法组术后第2 天介入按法干预，其余两组不予按法刺激，仅捆绑固定。

1.2 主要仪器和试剂

冷冻离心机（型号：DDL-5，上海安亭科学仪器）；倒置荧光数码显微镜（型号：TS100FIX73-U，Nikon 公司）；小动物心电图仪（型号：ECG-2303B，广州三锐电子科技有限公司）；自动酶标仪（型号：Infinite F50，瑞士帝肯公司）；双通道色谱工作站（型号：N-2000，日本岛津公司）。 生理盐水（批号：CZ0108，北京雷根生物技术有限公司）；4%多聚甲醛（批号：BL539A，北京白鲨易科技有限公司）；LDH试剂盒（批号：70120，山东博科生物产业有限公司）；cTnI 试剂盒（批号：JM-01784R2）、CK-MB 试剂盒（批号：JM-02031R2）、ATP 试 剂 盒（批 号：ADSYS-122）、ADP 试剂盒（批号：ADS-YS-128）、AMP试剂盒（批号：ADS-YS-135）均来自江苏晶美生物科技有限公司。

1.3 造模方法

参考文献[9]以冠脉左前降支结扎术建立大鼠心肌缺血模型。

1.3.1 术前准备 提前配置10%水合氯醛溶液，按照腹腔注射280 mg/kg（0.004 mL/g）剂量麻醉大鼠，仰卧位固定于自制手术台备皮，乙醇消毒胸前和四肢皮肤，用眼科剪和眼科镊分离大鼠颈部皮肤及皮下组织，暴露气管行气管插管术，连接实验小动物呼吸机（呼吸频率45～65 次/min，呼吸比1∶1，潮气量为20 mL）和小动物心电图仪。

1.3.2 手术造模 准备完毕后，用手术剪剪开大鼠3～4 肋间左侧皮肤，用弯头镊顺着肌肉纹理钝性分离皮下组织，用眼科镊分离3、4 肋间肌肉，夹出胸腺（色白如脂）并用眼科拉钩固定，剥离心包膜，充分暴露心脏冠状动脉左前降支，用6-0 号缝合线穿过结扎并拉紧丝线，建立心肌缺血模型，逐层缝合肋骨、皮肤，涂抹碘伏、乙醇，再次消毒以防感染。 模型评价：结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支后，结扎局部心肌明显变白，心电图Ⅱ导联ST 段抬高，以PR 段为基线，记录QRS 波群终点与ST 段交接处的J 点位移，该点上升或下降0.1 mV 或以上，则视为造模成功[10]。取造模前、造模后、干预后共计3 个时间点，每个时间点测4 个波型，取其平均值，记录并计算J 点变化值，无论升高或降低，取其变化绝对值。

1.4 干预方法

参照胡元亮《实用动物针灸手册》[11]有关标准，采用拟人比照法选取双侧心俞（背部，第五胸椎后两旁的肋间中，左右侧各一穴），将造模48 h 后大鼠俯卧位捆绑于按摩床（专利号：201720875965.4），穴位局部备皮。 根据前期实验数据[6]，将自制按法刺激仪的力量参数设置为0.14 kg，并于双侧心俞穴行按法刺激，单侧刺激时间7.5 min，双侧共计15 min，其余两组不予按法刺激，仅捆绑固定。 每次干预或捆绑15 min，每日1 次，连续7 d。

1.5 指标检测

1.5.1 心电图J 点位置 将每组12 只大鼠仰卧位固定在手术台上，连接小动物心电图仪，待稳定后，分别记录、比较大鼠造模前、造模后、干预后的标准Ⅱ导联心电图的J 点（QRS 波群的终点与ST 段交接处）位移。

1.5.2 心肌酶含量 分别于大鼠造模、干预后对各组大鼠血液进行采集，通过腹主动脉采集血液4～5 mL，置于高速离心机中以3000 r/min 速度离心15 min，取上清液2～3 mL，置于-80 ℃冰箱冷冻保存，按照试剂盒说明书操作步骤测定大鼠血清中肌钙蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）、肌酸激酶MB 同工酶（creatine kinase MB isoenzymes, CK-MB）、乳酸脱氢酶（layered double hydroxide, LDH）含量。本次实验取每组12 只大鼠的血清检测心肌酶含量时，假手术组1 例、模型组1 例、按法组2 例样本均出现溶血现象，直接剔除，未纳入统计。

1.5.3 心肌组织病理形态变化 每组随机选取6 只大鼠的全心样本用于HE 染色。从4%多聚甲醛溶液中取出心肌组织样本，石蜡包埋后切片，常规脱水包埋，使其切片脱蜡至水，苏木精水溶液中染5 min，用流水冲洗，盐酸乙醇中分化3 s，流水冲洗15 min后入蒸馏水5 min，再入70%和90%乙醇中脱水各10 min，入伊红染色液染色2 min，再以无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，放置盖玻片，晾干后于显微镜下观察，并用电脑拍照记录。

1.5.4 心肌细胞能量代谢水平 除去上述用于HE染色大鼠，每组剩余6 只大鼠的心肌组织用于心肌能量代谢物质含量检测。 完成末次心电图测量后，将大鼠断颈处死，取心脏，用生理盐水将心脏内残血冲洗干净，剔除血管、脂肪等非心肌组织，利用吸水纸去除多余水分，沿着冠状沟切除心房，留下心室，将心肌组织在匀浆介质中制成匀浆液后，按照试剂盒说明书操作步骤测定其三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）含量，最后计算能荷值（energe charge, EC）。

1.6 统计学方法

应用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。 计量资料以“±s”进行描述，若符合正态分布和方差齐性，采用单因素方差分析并以LSD 或SNK-Q 法进行多重比较；若不符合方差齐性，采用Kruskal-Wallis H 检验；重复测量数据采用重复测量设计方差分析。所有数据均以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心电图J 点位置比较

造模后，模型组和按法组大鼠心电图J 点位置较假手术组、造模前明显上抬(P＜0.05)，说明造模成功。干预后，模型组和按法组J 点位置均较造模后明显下移(P＜0.05)；与模型组相比，按法组大鼠心电图J 点位置明显下移(P＜0.05)。 详见表1。

表1 3 组大鼠心电图Ⅱ导联J 点位置比较（±s，mV）

表1 3 组大鼠心电图Ⅱ导联J 点位置比较（±s，mV）

注：与造模前比较，△P＜0.05；与造模后比较，□P＜0.05；与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05。

组别假手术组模型组按法组n 12 12 12造模前0.20±0.04 0.18±0.05 0.17±0.03造模后0.22±0.02 0.36±0.05△*0.37±0.06△*干预后0.19±0.04 0.30±0.06△□*0.21±0.04□★

2.2 各组大鼠血清心肌酶含量比较

与假手术组相比，模型组大鼠血清cTnI、CKMB、LDH 含量明显升高(P＜0.01)，按法组大鼠血清cTnI 含量明显降低(P＜0.01)，但血清CK-MB、LDH含量明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，按法组大鼠血清cTnI、CK-MB、LDH 含量明显降低(P＜0.01)。 详见表2。

表2 3 组大鼠血清心肌酶含量比较（±s）

表2 3 组大鼠血清心肌酶含量比较（±s）

注：与假手术组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，□□P＜0.01。

组别假手术组模型组按法组n 11 11 10 cTnI/（μg/L）24.03±2.15 41.70±9.83△△19.05±0.71△△□□CK-MB/（U/mL）698.01±172.52 1 774.46±377.67△△1 175.59±81.64△△□□LDH/（U/mL）330.55±101.95 1 332.55±429.07△△695.00±107.62△△□□

2.3 各组大鼠心肌组织病理形态变化

假手术组心肌细胞结构清晰、边界整齐，未见炎性细胞浸润；与假手术组比较，模型组心肌损伤严重，心肌细胞排列紊乱、边界模糊，炎性细胞浸润，间质水肿伴出血，部分横纹坏死、溶解，提示手术造模后可产生心肌缺血样病理改变，成功建立心肌缺血大鼠模型；按法组心肌细胞结构较为清晰，可见少量炎性细胞浸润和出血，提示按法干预心俞穴可有效改善心肌缺血大鼠的心肌损伤状态。 详见图1。

图1 3 组大鼠心肌组织病理形态变化（HE，×200）

2.4 各组大鼠心肌细胞能量代谢物质含量比较

与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞ATP 含量、EC 值明显降低（P＜0.01），ADP、AMP 含量明显升高（P＜0.01）；与模型组对比，按法组心肌细胞ATP含量、EC 值明显升高（P＜0.01），AMP 含量明显降低（P＜0.01）。 详见表3。

表3 3 组大鼠心肌细胞能量代谢物质含量比较（±s，nmol/L）

表3 3 组大鼠心肌细胞能量代谢物质含量比较（±s，nmol/L）

注：与假手术组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，□□P＜0.01。

组别假手术组模型组按法组n 66 6 ATP 4 799.90±280.92 2 798.19±392.27△△5 189.96±222.99□□ADP 3 594.89±90.44 5 056.79±234.67△△4 515.60±872.70 AMP 35.02±1.80 39.00±0.80△△24.89±1.05△△□□EC 0.79±0.01 0.67±0.02△△0.77±0.02□□

3 讨论

3.1 按压心俞对心肌缺血大鼠的保护作用

张仲景在《金匮要略》中正式提出“胸痹”名称，认为阴寒内盛、胸阳痹阻、心脉凝滞、不通则痛是该病的主要病机，当以散寒通阳、活血止痛为法[12]。 按法作用机制关键为“按之则热气至，热气至则痛止矣”，即按法“热气至”效应具有散寒止痛之功，热气至则阴寒散，阴寒散则气血通，通则不痛，可有效治疗“胸痹心痛”，即冠心病心绞痛[13]。 临床研究表明，穴位按压应用于冠心病心绞痛的急救，起效迅速且没有不良反应[14]。 其中，心俞穴作为心之背俞穴，可通过经络气街直接联络心脏，因此，古代医家治疗胸痹心痛时，膀胱经常用穴、背部常用穴、常用背俞穴都是心俞穴[15]，可见心俞穴是治疗胸痹心痛的要穴之一。 同时，基础研究表明，刺激心俞穴可抑制中枢神经系统的兴奋性氨基酸过度释放，缓解其兴奋性神经毒性的产生，保护缺血心肌[16]；可降低大鼠血清心肌酶水平，改善缺血心肌损伤状态[17-18]；可通过上调外周血管内皮生长因子的表达，减轻缺血心肌血管内皮细胞的受损程度[19]；可提高机体抗氧化能力，降低心肌组织脂质过氧化反应程度，保护受损心肌细胞[20]。

本实验发现，结扎大鼠冠状动脉左前降支后，心电图Ⅱ导联J 点上移，提示心肌缺血模型成功建立，干预7 d 后再次检测心电图，发现其Ⅱ导联J 点下移，符合心肌缺血的心电变化规律和诊断标准[21]，提示未经治疗的模型组心肌缺血情况尚未显著好转。按法组大鼠造模成功后，经7 d 按压心俞治疗，心电图Ⅱ导联J 点位置均低于干预前，提示按压心俞可有效改善心肌缺血状态，与团队前期研究结果相符[22]。心肌组织病理形态变化是反映急性心肌缺血程度的重要指标，动物实验应用广泛，亦可作为心肌缺血大鼠按法治疗效果的判断标准之一[23]。 本实验HE 染色显示，模型组呈现缺血样改变，按法组病理形态改变显著，提示按压心俞穴能明显改善大鼠心肌缺血状况。

3.2 按压心俞穴改善缺血心肌能量代谢的作用机制

当心脏缺血缺氧时，ATP 分解增加、合成减少，以维持机体能量供应，一旦能量供需失衡会引发氧代谢异常，导致无氧酵解成为ATP 产生的重要来源，严重损害细胞正常功能，加速自由基产生，引起脂质过氧化，同时，诱发钙超载破坏心肌细胞结构，促进细胞凋亡、坏死，加重心肌缺血，严重影响心肌正常生理功能，临床上常表现为胸闷、心绞痛等心肌缺血症状[24]。 机体可通过对能量代谢物质含量的调控，抑制线粒体凋亡通路的激活，减少心肌酶、炎性因子、氧自由基的产生与释放，保护缺血心肌[25]。 其中，能量代谢物质（ATP、ADP、AMP）作为维持正常生理机能的主要能量来源，检测其含量变化是阐释机体能量代谢活动及其规律的重要途径。 cTnI 作为调节心肌收缩的主要蛋白之一，正常情况下无明显表达，当心肌细胞出现损伤时，该蛋白以游离形式大量释放入血[26-27]；CK-MB 在心肌细胞中含量最多，属于肌酸激酶同工酶，常作为心肌缺血的辅助诊断指标[28]；LDH 作为糖酵解酶，其活性可反映心肌损伤程度[18]。 当大鼠因心肌缺血引发心肌损伤时，细胞膜通透性增加，上述3 种心肌酶透过细胞膜大量释放入血，致使血清心肌酶含量异常升高，检测其血清含量变化是诊断机体心肌损伤及其恢复程度的重要指标。

本研究发现，与假手术组相比，模型组大鼠血清心肌酶含量显著升高，心肌细胞ATP、EC 水平降低，ADP、AMP 含量升高，提示心肌缺血时，心肌细胞中心肌酶大量外溢，导致血清心肌酶含量升高，同时，ATP 大量分解为ADP、AMP，以维持心肌能量供应。团队前期研究表明，按法可提高缺血心肌的能量代谢物质含量，改善局部血液循环和能量代谢障碍[22]。本实验发现，与模型组相比，按法组大鼠心肌酶含量明显降低，ATP、EC 水平明显升高，AMP 含量下降，表明按压心俞穴可能保护心肌细胞膜的完整性，减少心肌酶外溢入血，降低血清心肌酶含量，同时，减缓心肌细胞ATP 分解为ADP、AMP 的速度，保护缺血心肌。 何永刚[29]通过对心肌缺血模型大鼠予以针刺治疗，实验发现针刺能够显著抑制其心电图ST段抬高，减小心肌梗死面积，升高心肌组织ATP 的含量，降低AMP 的含量，缓解心肌能量代谢障碍，与本次实验结果相符。

综上所述，按压心俞穴可有效改善心肌缺血大鼠心电和心肌病理变化，抑制心肌细胞心肌酶释放和ATP 分解，作用机制可能是通过抑制心肌ATP分解，减少ADP、AMP 含量，提高ATP 含量和EC 水平，改善能量代谢障碍，同时，抑制心肌酶外溢入血，保护心肌细胞。但是本实验尚存不足，细胞自噬和凋亡是调节细胞能量代谢的重要机制，本实验未在细胞自噬和凋亡方面进行深入研究，因此，在未来的实验中将会进一步探讨。