基于中医药配伍理论吴茱萸有效成分含量测定及配比关系研究*

张媛媛 彭智祥 陈超 胡燕珍 杨海燕 黄斌 虞金宝 陈乐#（江西省中医药研究院中药所 南昌 330046；2江西道地特色中药材标准化重点研究室 南昌 330046）

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实。味辛、苦，性热，有小毒；具散寒止痛、助阳止泻、降逆止呕等功能[1]。现代研究表明，吴茱萸中含有多种化学成分，主要为生物碱类、柠檬苦素类、挥发油类、木质素类、黄酮、多糖等[2]。其中生物碱类和柠檬苦素类是其主要活性成分，具有镇痛、抗炎、抗氧化等功效[3]。

2020 年版《中国药典》以吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素为指标对吴茱萸进行质量控制，规定含吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总量不得少于0.15%，柠檬苦素不得少于0.20%[1]，现有文献报道以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱、去氢吴茱萸碱、二氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、柠檬苦素等多成分指标含量控制吴茱萸的质量[4～6]，但这仍然停留在“唯含量论”的水平。本研究基于中医药理论的整体观认为中药复方是一个整体，通过药物的有机配伍，多靶点、多途径发挥疗效，而单味中药也是一个小整体，物质基础之间相互协同、相互制约，多靶点、多环节地发挥疗效，发挥药效的各成分贡献率不同，各单体成分之间均存在一种量的关系，当这种量的关系存在一个最佳比例关系时，可以使中药整体达到最大效应[7]。贾晓斌等采用细胞模型对多个产地夏枯草属药材进行活性成分筛选，结果发现江苏和安徽夏枯草中咖啡酸、迷迭香酸等6种成分含量虽然较低，但药效最好，且结构比相似，说明夏枯草属药材治疗肺癌的有效成分具有稳定、有序的整体结构[8]。夏昀卿等以“组分结构”理论为指导，分析道地牡丹皮的物质基础结构特征，结果发现道地牡丹皮与非道地牡丹皮特征成分中氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷之间量与量的配比关系具有差异性，道地牡丹皮的特征成分结构比具有独特性[9]。刘丹等将银杏内酯组分中活性成分进行配比，并结合药效实验，初步确定了银杏内酯优化组分结构[10]。

根据文献报道，去氢吴茱萸碱[11～14]对阿尔茨海默病和胃溃疡等疾病具有良好的疗效，柠檬苦素[15～18]具有抗炎、镇痛、抗胃癌、抑制人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、抗动脉粥样硬化和杀虫等作用，且在药材中的含量高达约2%，吴茱萸碱和吴茱萸次碱[19～22]具有明显的治疗心血管和抗肿瘤的疗效。由此，本研究将以去氢吴茱萸碱（Dehydroevodiamine）、柠檬苦素（Limonin）、吴茱萸碱（Evodiamine）、吴茱萸次碱（Rutaecarpine）作为有效成分配比关系研究的研究对象，建立吴茱萸药材主要有效成分含量测定和配比关系研究的实验方法，并对江西境内及省外吴茱萸药材主要有效成分含量及配比关系进行初步探讨，为吴茱萸道地性研究提供新思路与新方法，以期为道地吴茱萸质量标准的制定提供科学依据。现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters e2695高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、柱温箱、UV/Vis检测器）；Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司，DAD检测器）；Dikmatech Diamonsil Plus C18（5 μm,250 mm×4.6 mm，柱 号：2509215，Dikma Technologies）；Agilent HC-C18（5 μm,250 mm×4.6 mm，柱 号：538639，Agilent Technologies）；Waters Symmetry Shiled RP18色谱柱（5 μm,4.6 mm×250 mm）；Mettler AG 135电 子 天 平（瑞 士Metter TOLEDO，感量：0.01 mg/0.1 mg）；YP5001型电子天平（上海光正医疗仪器有限公司，感量：0.1 g）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9101-2SA型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；FY-1H型旋片式真空泵（浙江飞越机电有限公司）；103B型200 g高速中药粉碎机（浙江省瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 材料

1.2.1 实验用药材 经江西省中医药研究院虞金宝研究员鉴定为吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.。药材信息见表1。

表1 实验用吴茱萸药材信息

1.2.2 试药 去氢吴茱萸碱（批号：Q-068-170426，纯度为＞98%）、吴茱萸碱（批号：W-012-161216，纯度为＞98%）、吴茱萸次碱（批号：W-013-161216，纯度为＞98%）购于成都瑞芬思生物科技有限公司，柠檬苦素（批号：CF202002，纯度≥98%）购于Chem Faces公司；乙腈和甲醇（色谱纯）；磷酸、三乙胺、甲酸均为分析纯，娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Dikmatech Diamonsil Plus C18（5 μm,250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈（A）-缓冲盐（0.02%磷酸，B）；检测波长：215 nm；流速：1 ml/min；柱温：25℃；进样量10 μl；梯度洗脱（0～15 min，33%～35% A；15～46 min，35%～35% A；46～54 min，35%～100% A；54～66 min，100%～100% A；66～69 min，100%～33%A；69～75 min，33%～33%A）。

2.2 混合对照品溶液的配制 精密称取去氢吴茱萸碱12.26 mg和吴茱萸次碱6.54 mg，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得去氢吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品贮备液；精密称取柠檬苦素16.18 mg和吴茱萸碱8.14 mg，分别置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得柠檬苦素和吴茱萸碱对照品贮备液。再分别精密吸取上述对照品贮备液各2 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品母液。再精密吸取混合对照品母液5 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1毫升分别含去氢吴茱萸碱122.60 μg、吴茱萸次碱65.40 μg、柠檬苦素64.72 μg和吴茱萸碱32.56 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 分别取过3号筛的吴茱萸粉末约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，称定重量，浸泡1 h，超声处理（功率：250 W，频率：40 kH）60 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 将“2.2”项下混合对照品母液逐步稀释成5份，得到去氢吴茱萸碱质量浓度分别为245.20 μg/ml、122.60 μg/ml、61.30 μg/ml、30.65 μg/ml、15.32 μg/ml、7.66 μg/ml，柠檬苦素质量浓度分 别 为258.88 μg/ml、129.44 μg/ml、64.72 μg/ml、32.36 μg/ml、16.18 μg/ml、8.09 μg/ml，吴茱萸碱质量浓度分别为65.12 μg/ml、32.56 μg/ml、16.28 μg/ml、8.14 μg/ml、4.07 μg/ml、2.04 μg/ml，吴茱萸次碱质量浓 度 分 别 为119.00 μg/ml、59.50 μg/ml、29.75 μg/ml、14.88 μg/ml、7.44 μg/ml、3.72 μg/ml的对照品溶液。各取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标（y），以对照品质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，得回归方程、相关系数和线性。见表2。

表2 吴茱萸中4个对照品的线性关系和范围

2.4.2 定量限与检测限考察 精密吸取“2.2”项下的去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品贮备液适量，分别倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以信噪比10：1、3：1分别计算定量限和检测限。结果去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱定量限为0.071 2 μg/ml、0.759 0 μg/ml、0.202 1 μg/ml、0.321 6 μg/ml，检测限0.022 5 μg/ml、0.256 0 μg/ml、0.098 6 μg/ml、0.122 3 μg/ml。

2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱峰面积，结果去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.07%、1.59%、1.16%、1.18%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取江西新余吴茱萸药材（批号：H1）粉末6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定其含量，结果去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为1.85%、1.96%、2.77%、2.93%（n=6）。结果表明，本法重复性良好。

2.4.5 稳定性考察 取江西新余吴茱萸药材（批号：H1）粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0 h、3 h、6 h、12 h、16 h、20 h、26 h时进样10 μl测定，结果去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为0.98%、1.09%、1.39%、1.36%（n=6）。结果表明，供试品溶液在26 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取江西新余吴茱萸药材（批号：H1）粉末6份，每份各0.15 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入1.120 0 μg/ml的去氢吴茱萸碱，0.372 8 μg/ml的吴茱萸碱，0.181 2 μg/ml的吴茱萸次碱的对照品溶液各1 ml，0.660 8 μg/ml的柠檬苦素2 ml，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果：去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱回收率分别为92.30%～95.30%（RSD=1.25%，n=6）、100.90%～106.90%（RSD=1.91%，n=6）、96.90%～103.30%（RSD=2.46%，n=6）、92.80%～98.20%（RSD=2.23%，n=6）。

2.5 吴茱萸中4种成分含量测定及含量配比 取36个不同产地不同批次的吴茱萸样品粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中4个成分的含量及含量配比。见表3、图1。

表3 不同产地吴茱萸中4种成分平均质量分数（mg/g）及配比关系

续表

图1 混合对照品溶液和供试品溶液高效液相色谱图

图2 36批吴茱萸样品含量测定结果聚类分析树状图

2.6 含量测定结果聚类分析 将吴茱萸中4个成分的含量导入SPSS21.0软件，以欧式平方距离为测度 进 行 聚 类 分 析，H24、H27、H2、H8、H9、H3、H7、H19、H35、H6、H36、H4、H11、H5、H1、H14、H15号样品聚为第1类，H22、H23、H31、H32、H33、H12、H25、H10号样品聚为第2类，H21、H29、H28、H34、H13、H18、H26号样品聚为第3类，H16、H30号样品聚为第4类，H17号和H20分别单独聚为1类。见图2。

2.7 含量测定结果判别分析（1）江西省位于24°～30°N，南北长、东西窄，地处亚热带，东西南三面环山，北部地区为鄱阳湖平原，中间以山地丘陵为主，复杂的地貌使江西的气候资源的时空分布也差异明显。根据纬度将江西至北向南分为4个板块，板块一纬度为29°30′～29°71′，主要包含上饶、九江、景德镇；板块二纬度为27°81′～28°69′，主要包含南昌、宜春、鹰潭；板块三纬度为27°12′～27°60′，主要包含新余、吉安、抚州、萍乡；板块四纬度为24°29′～27°09′，为赣州[23]。（2）以聚类分析的分类结果作为判别分析的分组依据，采用SIMCA14.1对36批吴茱萸样品中4个成分的含量进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），绘制OPLS-DA散点得分图，结果显示，36批样品可聚为六类，其中第1类样品包含H24、H27、H2、H8、H9、H3、H7、H19、H35、H6、H36、H4、H11、H5、H1、H14、H15号，产地主要集中在第三和第四板块；第2类样品包含H22、H23、H31、H32、H33、H12、H25、H10，产地主要集中在第一板块；第3类样品包含H21、H29、H28、H34、H13、H18、H26，产地主要集中在第二板块；第4类样品包含H16、H30，产地为广西；第5类样品包含H20，产地为重庆；第6类样品包含H17，产地为四川；OPLS-DA分类结果与聚类分析的结果一致，在不同算法介导下的分类方法得到的分类结果一致，足见该分类结果是可信的。根据正交偏最小二乘判别分析VIP值可知，柠檬苦素、吴茱萸碱的VIP值＞1，对分类的贡献比较大。由判别分析和聚类分析结果可知江西各地吴茱萸含量测定结果分布比较集中，但也存在区别，自北向南存在差异。其中湖北、湖南、浙江等江西周边省份样品测定结果与江西的聚在一起，而广西、重庆、四川等距离江西较远省份样品测定结果出现离群现象。见图3、图4。

图3 36批吴茱萸样品正交偏最小二乘判别分析得分图

图4 吴茱萸样品正交偏最小二乘判别分析VIP值

2.8 配比关系结果判别分析 在含量测定结果聚类分析和判别分析结果的基础上，采用SIMCA14.1对36批吴茱萸样品中4个成分的含量配比结果进行正交偏最小二乘判别分析，绘制OPLS-DA散点得分图。结果显示，36批样品大致可聚为4类，H21、H29、H28、H13、H18、H26、H34、H15号 样 品 聚 为1类，含 量 配 比 为1：（2.83～4.19）：（1.42～2.24）：（0.50～0.67）产地主要为板块二（南昌、宜春、鹰潭）；H10、H25、H31、H32、H22、H23、H12、H33号样品聚为2类，含量配比为1：（1.72～2.49）：（1.00～1.40）：（0.38～0.57），产地主要为板块一（上饶、九江、景德镇）；H14、H36、H4、H6、H5、H35、H19号样品聚为3类，含 量 配 比 为1：（1.46～1.90）：（0.16～0.25）：（0.09～0.13），产地主要为板块四（赣州）；H1、H24、H27、H2、H7、H9、H3、H11、H8号样品聚为4类，含量配比为1：（2.24～2.86）：（0.05～0.61）：（0.04～0.27），产地主要为板块三（新余、吉安、抚州）；H16和H30、H20、H17离中心较远，产地主要为广西、重庆和四川。由聚类结果可推出受南北生态差异的影响，自北向南成分之间的配比关系存在差异。见图5。

图5 36批吴茱萸样品配比关系正交偏最小二乘判别分析得分图

3 讨论

本研究比较了40%～100%乙醇、纯甲醇提取溶剂、超声时间20～80 min、溶剂用量15～50 ml对吴茱萸药材中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的整体提取效果。结果发现当提取条件为70%乙醇50 ml浸泡1 h，超声提取60 min时4种化学成分提取率最高。比较了0.1%三乙胺-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈（甲醇）等流动相，结果发现以0.1%磷酸-乙腈作流动相时基线平稳，各成分达到基线分离。进而比较不同浓度磷酸（0.02%～0.15%）对试验结果的影响，结果显示磷酸浓度的高低对基线和峰形的影响较小，磷酸的浓度最终定为0.02%，选用0.02%磷酸-乙腈为流动相。

在其他色谱条件不变，只改变色谱柱（Dikmatech Diamonsil Plus C18、Agilent HC-C18、Waters RP18色谱柱）的情况下，分别测定供试品中有效成分的含量。结果显示，去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰与前后峰均达到基线分离，含量的RSD均＜3.0%（n=3）。说明不同色谱柱对测定结果影响较小。

采用二极管阵列检测器，分别对4个待测成分在190～400 nm进行紫外吸收全波长扫描。结果去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的最大吸收波长分别为210 nm、250 nm、370 nm；210 nm、270 nm；224 nm；220 nm、240 nm、340 nm，为了兼顾4个成分的均有较大吸收并具备良好的基线，最终检测波长确定为215 nm。

众所周知，中药的药效物质基础是一个稳定有序的整体，物质基础具有稳定、有序、整体性的结构，在测定主要活性成分含量的基础上，进一步分析主要活性成分的配比关系可以更好地控制中药材质量，这也将成为全面控制药材质量标准的新思路。

笔者基于中医药配伍理论，测定了江西区域及其他省份的吴茱萸药材中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量，并计算配比关系，结果赣 州 含 量 配 比 为1：（1.46～1.90）：（0.16～0.25）：（0.09～0.13）；新余、吉安、抚州含量配比为1：（2.24～2.86）：（0.05～0.61）：（0.04～0.27）；南昌、宜春、鹰 潭 含 量 配 比 为1：（2.83～4.19）：（1.42～2.24）：（0.50～0.67）；上饶、九江、景德镇含量配比为1：（1.72～2.49）：（1.00～1.40）：（0.38～0.57），广西含量配比为1：（7.87～9.22）：（4.27～4.98）：（1.20～1.26）、重庆含量配比为1：5.50：2.97：0.99和四川含量配比为1：20.64：4.49：0.62，由以上数据可知不同区域吴茱萸均含去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱4个有效成分，但量和量的配比关系有明显区别，其中上饶、九江、景德镇、南昌、宜春、鹰潭等江西中北部地区的配比关系比较接近，存在稳定有序的结构比，且距离该区域越远，其配比关系差异越明显，这也正符合唐代陈藏器所指：“茱萸南北总有，但其效不同，入药者以吴地为好。”吴地即为江西中北部地区。但其药效最佳是否受配比关系影响有待后期的药效试验加以验证。以上结果表明，不同区域吴茱萸药材有效成分含量及量与量间的配比关系存在差异，造成此现象的原因可能是不同产区地理位置、气候环境、土壤结构等因素存在不同。此外，本研究只是初步分析比较了江西省内不同区域及少量省外吴茱萸药材中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱配比关系的特点和差异，后续还将继续增加样本量并开展药效实验，优选出药效最佳的配比关系，为吴茱萸药材道地性研究提供新思路与新方法，为道地吴茱萸药材质量标准的制定提供科学依据。