丹酚酸A通过lncRNA B调控TGF-β/Smads通路改善阿霉素诱导的心力衰竭的机制研究*

艾文伟 张明 熊力 周淑兰（江西省人民医院 南昌 330006）

心力衰竭是各种类型心脏病的最终状态，其心肌病理改变通常是心肌肿大、凋亡、纤维化共存的[1]。现今许多学者研究中医药治疗该病的方法，在临床中也较为广泛。丹酚酸A是丹参重要的水溶性有效成分，有保护心脏的作用；其可以显著去除自由基并且保护羟基自由基造成的线粒体氧化损伤，具有一定的抗氧化功能，而且还能控制凋亡基因的表达[2]。目前关于该病的生物学机制以及潜在的分子学机制还不够明确。有研究认为该病的发病可能有长链非编码RNA（lncRNA）参与，还有可能是与调控TGF-β/Smads信号通路有关[3]。但是目前相关研究较少，因此，本研究通过构建细胞模型和动物心衰模型来探讨丹酚酸A对阿霉素诱导的心力衰竭的影响，以确定其相关机制。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料（1）细胞：H2C9细胞株，由中国协和细胞库提供，于含有10%胎牛血清的培养基中培养，取对数生长期细胞进行实验。（2）实验动物：取30只无特定病原体（SPF）级、8周龄、健康、体质量在25 kg左右的雄性C57BL/6小鼠，在26℃下饲养，自由饮食。本研究经南昌大学实验动物科学中心伦理委员会批准（伦理批号：20140729）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组与转染 培养细胞至对数生长期后，进行细胞分组：（1）空白对照组：正常培养心肌细胞12 h。（2）模型组：用8 μmol/L的阿霉素处理细胞12 h。（3）丹酚酸A低剂量组：以10 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同处理细胞12 h。（4）丹酚酸A中剂量组：以20 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同处理细胞12 h。（5）丹酚酸A高剂量组：以40 μmol/L的丹酚酸A和8 μmol/L的阿霉素共同处理细胞12 h。（6）lncRNA B抑制组：转染稳定沉默lncRNA B-inhibitoir表达细胞株（lncRNA B-inhibitor），验证转染成功后，以8 μmol/L的阿霉素处理细胞12 h。

1.2.2 小鼠建模及分组 将小鼠随机分为：对照组（n=6），阿霉素性心力衰竭模型组（n=6），丹酚酸A低浓度组（n=6）、丹酚酸A中浓度组（n=6）、丹酚酸A高浓度组（n=6）。除对照组外的每只小鼠在2周内通过腹腔注射阿霉素6次，每次剂量2.5 mg/kg，建立小鼠心力衰竭模型，对照组小鼠注射等体积的生理盐水；丹酚酸A低、中、高剂量组的小鼠在建模成功后，通过灌胃分别服用10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的丹酚酸A，处理2周后进行下一步检测。

1.3 观察指标

1.3.1 PCR检测lncRNA B和转化生长因子-β（TGF-β）水平 使用miRNA分离试剂盒从动物模型组和细胞模型组中分别分离总RNA。反应条件按照cDNA合成试剂盒的说明进行设置。反应条件：95℃预变性10 min、95℃下变性15 s、60℃退火32 s，循环50次后测定其溶解曲线，测定好后通过计算机系统自动分析各个样本的Ct值，再计算lncRNA B和TGF-β的相对表达量。

1.3.2 MTT检测细胞增殖 将各组细胞加入孔板中，每组加3个孔，在5%CO2、37℃下培养12 h，置于显微镜下观察。在每孔中加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，继续培养4 h后终止培养。向每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO）并放置于摇床上震荡10 min后，使用酶联免疫检测仪检测各孔在490 nm处的OD值，并计算出各组的细胞存活率。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，将细胞用异硫氰酸荧光素（FITC）凋亡检测试剂盒在室温下进行染色1 h。最后用流式细胞仪进行测定分析。

1.3.4 检测小鼠心脏功能 对小鼠腹腔进行消毒后，注射戊巴比妥麻醉，将小鼠固定至操作台后，用肝素尾静脉注射。通过颈部中央切口切开表皮，仔细分离每一层组织，露出右侧颈动脉，颈动脉远端用手术线结扎，之后利用动脉夹关闭颈动脉近心端，利用显微剪剪开总动脉缺口，插入P-V导管至小鼠的主动脉并延伸至左心室。记录15 min压力容积的数据。使用Pressure Vol Anal软件分析其血流动力学的相关数据，获得左室内压最大上升速率（dp/dtmax）、左室内压最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）等数据。

1.3.5 检测小鼠生化指标 在模型建立后2周，分别对各组小鼠进行腹主动脉取血，并且对其血清进行分离处理，然后用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法测定其心力衰竭相关指标，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、同型半胱氨酸（Hcy）、内皮素（ET）水平。1.3.6观察小鼠心肌组织病理学变化 处死小鼠后，剪开心脏，取下左心室，使用冷生理盐水进行冲洗，用5%的多聚甲醛进行固定。固定48 h后用酒精进行脱水，用石蜡进行包裹，切片，然后HE染色，最后用光学显微镜观察。

1.3.7 Western Blotting（WB）法检测相关蛋白表达利用RIPA裂解缓冲液分别提取动物组和细胞组的心肌细胞裂解物，利用SDS-PAGE电泳分离蛋白，之后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉密封，一抗TGF-β1、Smad2、Smad3抗体4℃孵育过夜。膜与二抗共孵育，ECL底物试剂盒检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS22.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组之间采用LSD-t检验多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞和各组小鼠lncRNA B和TGF-β表达水平比较 细胞实验中，与空白对照组相比，模型组lncRNA B和TGF-β表达较高，与模型组比，丹酚酸A各剂量组和lncRNA B抑制组表达较低，P＜0.05；动物实验中，与对照组相比，阿霉素性心力衰竭模型组lncRNA B和TGF-β表达较高，而经丹酚酸A干预后，表达降低，P＜0.05。见表1、表2。

表1 细胞实验中各组细胞lncRNA B和TGF-β表达水平比较（±s）

表1 细胞实验中各组细胞lncRNA B和TGF-β表达水平比较（±s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。n=3是指重复了3次实验。

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表2 动物实验中各组小鼠lncRNA B和TGF-β表达水平比较（±s）

表2 动物实验中各组小鼠lncRNA B和TGF-β表达水平比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与阿霉素性心力衰竭模型组相比，#P＜0.05。

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2.2 细胞实验中各组细胞存活率与凋亡率比较与空白对照组相比，模型组存活率较低，凋亡率较高；与模型组相比，丹酚酸A各剂量组和lncRNA B抑制组存活率较高，凋亡率较低，P＜0.05。见表3。

表3 细胞实验中各组细胞存活率与凋亡率比较（%，±s）

表3 细胞实验中各组细胞存活率与凋亡率比较（%，±s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。n=3是指重复了3次实验。

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2.3 各组小鼠血流动力学参数比较 与对照组相比，阿霉素性心力衰竭模型组dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP水平较低，LVEDP水平较高，而经丹酚酸A干预后，其水平发生逆转，P＜0.05。见表4。

表4 各组小鼠血流动力学参数比较（±s）

表4 各组小鼠血流动力学参数比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与阿霉素性心力衰竭模型组相比，#P＜0.05。

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2.4 各组小鼠生化指标比较 与对照组相比，阿霉素性心力衰竭模型组生化指标较高，而经丹酚酸A干预后，生化指标水平好转，P＜0.05。见表5。

表5 各组小鼠生化指标比较（±s）

表5 各组小鼠生化指标比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与阿霉素性心力衰竭模型组相比， #P＜0.05。

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2.5 各组小鼠心肌组织病理学变化 空白对照组心肌组织未见明显病理改变，肌束排列整齐，心肌细胞间间隙均匀，未发生炎症细胞浸润和弥漫性水肿。模型组心肌组织表现为典型的心肌损伤，肌束紊乱，炎性细胞浸润，弥漫性水肿。丹酚酸A各浓度组心肌组织肌束排列逐渐有序，炎性细胞浸润和弥漫性水肿细胞逐渐减少。见图1。

图1 HE染色检测各组小鼠心肌组织病理学变化（×200）

2.6 各组细胞蛋白相关表达水平比较 细胞实验中，与空白对照组相比，模型组Smad2、Smad3蛋白表达较低，TGF-β1表达升高，与模型组相比，丹酚酸A各剂量组和lncRNA B抑制组蛋白表达均有所逆转。动物实验中，与对照组相比，阿霉素性心力衰竭模型组Smad2、Smad3蛋白表达降低，TGF-β1表达升高，而经丹酚酸A干预后，其相关蛋白表达反转，P＜0.05。见图2、表6、表7。

图2 各组相关蛋白表达比较

表6 细胞实验中各组细胞蛋白相关表达水平比较（±s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。n=3是指重复了3次实验。

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表7 动物实验中各组小鼠相关蛋白表达水平比较（±s）

表7 动物实验中各组小鼠相关蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与阿霉素性心力衰竭模型组相比，#P＜0.05。

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3 讨论

心力衰竭是威胁生命的心脏疾病，其特征是心脏结构或心功能受损，尤其是病理性或适应不良的心肌肥大，心室无法有效填充或泵送血液[4]；表现为缺血性、高血压性、感染性或遗传性心脏病，心力衰竭已成为心脏病学的主要挑战，并成为广泛研究的热点[5]。中医认为治疗心力衰竭主要以养身定志、活血化瘀为主，其中丹参可入心经，是治疗心力衰弱的重要药物，而丹酚酸A是丹参重要的有效成分[6]。此外，lncRNA作为重要的基因表达调控因子，越来越多的证据表明，其在各种心血管疾病中发挥着重要的调控作用[7～8]。若丹酚酸A可以通过lncRNA B对TGF-β/Smads信号通路产生调控作用，则丹参的中药应用及临床治疗就有了新的实验依据和循证学依据。

在本研究细胞实验中，与空白对照组相比，模型组lncRNA B和TGF-β表达较高，与模型组比，丹酚酸A各剂量组和lncRNA B抑制组表达较低。动物实验中，与对照组相比，阿霉素性心力衰竭模型组lncRNA B和TGF-β表达较高，而经丹酚酸A干预后，表达降低。这说明，lncRNA B在该病的发病机制中发挥着重要的作用，且lncRNA B表达升高可被丹酚酸A逆转。此外，在心肌细胞的存活率和凋亡率的实验观察中，丹酚酸A可以降低模型组细胞的凋亡率，并提高存活率，且lncRNA B抑制组也有同样的效果，也进一步佐证了丹酚酸A对心力衰竭有改善作用。在动物实验中，通过检测小鼠血流动力学指标、生化指标以及病理观察，也证实了丹酚酸A对心力衰竭的干预作用，其可改善心力衰竭小鼠的心功能且对心肌细胞的凋亡均有改善效果。有研究表明，TGF-β/Smads通路参与心肌损伤疾病，TGF-β1表达升高可通过传导Smads通路诱导细胞损伤，甚至是凋亡[9～10]。而Smad2、Smad3属于R-Smad，可通过TGF-β1受体激活转化，与该受体形成瞬时复杂激活途径[11～12]。因此，本研究通过检测细胞和小鼠中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达来确定其调控机制。结果显示，细胞实验中，与空白对照组相比，模型组Smad2、Smad3蛋白表达较低，TGF-β1表达升高；动物实验中与模型组相比，丹酚酸A各剂量组和lncRNA B抑制组蛋白表达均有所逆转；与对照组相比，阿霉素性心力衰竭模型组Smad2、Smad3蛋白表达降低，TGF-β1表达升高，而经丹酚酸A干预后，其相关蛋白表达反转。这说明，丹酚酸A可通过lncRNA B调控TGF-β/Smads信号通路，从而改善心力衰竭小鼠症状，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌组织。

综上所述，丹酚酸A可能通过lncRNA B调节TGF-β/Smads信号通路，保护阿霉素诱导的心力衰竭小鼠心肌组织损伤，改善组织病理学变化，降低细胞凋亡。然而，尽管本研究证实了丹酚酸A与TGF-β/Smads信号通路的相关性，不过所涉及的转录因子还需要进一步阐明。