2型糖尿病肾病患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表达特点及临床意义

韩敬，顾津伊，聂君旭，张艳萍，赵玲华

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病较严重和致命的并发症之一。DN早期以肾脏肥大为主要病理特征，随着病情进展，其可导致肾小球细胞外基质沉积和肾小管间质纤维化，最终发展为不可逆肾结构性损伤，引起终末期肾病［1］。2009—2012年我国2型糖尿病患者中DN的患病率为30%～50%，已超越肾小球肾病成为我国慢性肾病的首要原因［2-4］。DN早期症状隐匿，若不及时发现往往延误治疗时机，探寻DN相关生物标志物，早期发现、早期干预是改善患者预后的关键［5］。肾纤维化是肾脏功能衰退的主要病理基础，过度炎症反应可促使成纤维细胞增殖和过量基质蛋白积累，导致肾功能进行性下降，最终引发肾功能衰竭［6］。微小RNA（miRNAs）是一种单链非编码RNA，通过抑制或降解mRNA，从而调节其靶基因的表达，miRNAs已被证实在肾纤维化的发展中起重要作用［7］。有研究显示，在心房颤动大鼠模型中，通过诱导miR-27b-3p过表达，可靶向抑制Wnt3a表达，继而抑制Wnt/β-Catenin信号通路，抑制心肌细胞纤维化［8］。生物信息学分析表明，miR-342-3p在DN中表达下调，可能参与肾小管上皮细胞凋亡、肾间质细胞外基质的累积和纤维化进程［9］。目前，miR-27b-3p、miR-342-3p是否与DN有关尚不明确。本研究旨在探讨DN患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表达水平与DN的关系，以期为相关研究提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象选择2018年1月—2021年12月云南大学附属医院收治的2型糖尿病患者157例，诊断符合2017版《中国2型糖尿病防治指南》。排除标准：原发性肾脏疾病、肾先天畸形；伴恶性肿瘤、自身免疫疾病及急慢性感染性疾病；伴肺纤维化、肝纤维化、纵隔纤维化等纤维化疾病。根据患者尿白蛋白与肌酐比率（UACR）［10］将患者分为正常白蛋白尿（UACR＜30 mg/g，NA）组49例、微量白蛋白尿（30 mg/g≤UACR＜299 mg/g，MA）组41例、大量白蛋白尿（UACR≥300 mg/g，DN）组67例。3组年龄、性别构成及体质量指数（BMI）比较差异无统计学意义，具有可比性，见表1。本研究已经获得我院伦理委员会批准（伦理号：PZ-180212），患者或家属均签署知情同意书。

Tab.1 Comparison of baseline data between the three groups表1 3组基线资料比较

1.2研究方法

1.2.1一般资料收集收集受试者年龄，性别，BMI，吸烟史（烟龄20 a，吸烟量≥20包/a），合并疾病（高血压、高脂血症、冠心病、脑梗死），2型糖尿病病程，2型糖尿病家族史，是否合并视网膜病变，是否合并非酒精性脂肪肝，入院时收缩压和舒张压，降糖治疗用药情况（口服降糖药物、胰岛素皮下注射、口服降糖和胰岛素皮下注射联合用药）等。

1.2.2实验室检查2型糖尿病患者入院24 h内采集肘正中静脉血3 mL和尿液完善实验室常规检查。采用Spectra-Max®iD5多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）以双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测尿液中Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原肽（PCⅢ）水平，试剂盒购自奥维亚生物技术有限公司。参照刘旭辉等［11］方法采用实时定量聚合酶链反应检测miR-27b-3p、miR-342-3p。引物序列miR-27b-3p：上游5′-AGTGGCTAAGTTCTGCTCTCAAC-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′；miR-342-3p：上游5′-ACACTCCAGCTGGGAGGGGGTGCTATCTGTGAT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6（内参）：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。东芝40型全自动生化分析仪检测三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），根据CKD-EPI公式估算肾小球滤过率（eGFR）。放射免疫法（仪器为GC-1200 γ放射免疫计数器）检测尿微量白蛋白。美国强生稳定倍加型血糖仪检测末梢血空腹血糖（FPG），放射免疫法（日立h7060全自动化学免疫分析仪）检测空腹胰岛素（FINS）。计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=（FPG×FINS）/22.5，HA8160糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白（HbA1c）。

1.3统计学方法采用SPSS 25.00和MedCalc 19.0.4软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以±s表示，偏态分布经对数转换后使其符合正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。计数资料以例或例（%）表示，组间比较采用χ2检验，组间多重比较采用校正χ2检验。相关性分析采用Pearson相关。采用多因素Logistic回归分析危险因素。绘制受试者工作特征（ROC）曲线进行诊断效能分析，采用Delong test检验计算曲线下面积差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组一般资料比较3组吸烟史、高脂血症、冠心病、脑梗死、2型糖尿病家族史、舒张压、降糖治疗比例差异无统计学意义。与NA组比较，DN组和MA组2型糖尿病病程、收缩压均增加（P＜0.05），DN组高血压、合并视网膜病变、合并非酒精性脂肪肝比例增加（P＜0.05）。与MA组比较，DN组高血压、2型糖尿病病程、合并视网膜病变、合并非酒精性脂肪肝比例、收缩压均增加（P＜0.05），见表2。

2.2 3组实验室指标比较与NA组比较，MA组和DN组HbA1c、UACR、尿Ⅳ-C、尿LN、尿PCⅢ水平均增加，而miR-27b-3p、miR-342-3p表达均降低（P＜0.05），DN组BUN、Scr水平增加，而eGFR水平降低（P＜0.05）。与MA组比较，DN组HbA1c、BUN、Scr、UACR以及尿Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平均增加，而eGFR和miR-27b-3p、miR-342-3p表 达 均 降 低（P＜0.05），见表3。

2.3 影响DN的Logistic回归分析结果以是否患DN（否=0，是=1）因变量，以高血压（否=0，是=1）、2型糖尿病病程、视网膜病变（否=0，是=1）、非酒精性脂肪肝（否=0，是=1）、HbA1c、miR-27b-3p、miR-342-3p、收缩压、UACR、BUN、Scr、尿Ⅳ-C、尿LN、尿PCⅢ，eGFR为自变量。单因素Logistic回归结果显示，高血压、HbA1c、尿PCⅢ、eGFR、miR-27b-3p、miR-342-3p是DN发生的影响因素（P＜0.05），见表4。将单因素Logistic回归中差异有统计学意义的变量纳入多因素Logistic回归方程，采用逐步后退法选择和剔除变量，结果显示，较高水平的尿PCⅢ是DN的危险因素，而较高水平的miR-27b-3p、miR-342-3p、eGFR是保护因素（P＜0.05），见表5。

2.4 相关性分析DN组miR-27b-3p、miR-342-3p表达与eGFR呈正相关（r分别为0.647、0.661，P＜0.05），与尿PCⅢ呈负相关（r分别为-0.739、-0.766，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of baseline data and laboratory indicators between the three groups表2各组一般资料比较

Tab.3 Comparison of laboratory indicators between the three groups表3各组实验室指标比较 （±s）

Tab.3 Comparison of laboratory indicators between the three groups表3各组实验室指标比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与NA组比较，b与MA组比较，P＜0.05。

组别NA组MA组DN组F n 49 41 67 TC（mmol/L）5.19±1.42 5.21±1.53 5.28±1.55 0.276 TG（mmol/L）1.75±0.20 1.76±0.21 1.80±0.25 0.537 LDL-C（mmol/L）3.57±0.55 3.59±0.51 3.62±0.65 0.317 FPG（mmol/L）7.90±1.30 7.93±1.31 8.42±1.35 2.765 FINS（U/mL）8.79±1.83 8.82±1.93 9.05±2.33 1.805 HbA1c（%）5.02±1.21 6.12±1.34a 8.85±1.79ab 77.594＊＊HOMA-IR 3.08±0.59 3.11±0.97 3.39±1.08 2.861 BUN（mmol/L）5.65±1.35 6.12±1.09 35.26±6.32ab 1 044.950＊＊Scr（μmol/L）84.98±16.97 85.35±16.53 186.43±21.52ab 555.002＊＊组别NA组MA组DN组F UACR（mg/g）16.35±3.53 103.47±26.23a 369.02±41.42ab 839.418＊＊eGFR［mL/（min·1.73m2）］113.05±13.42 112.32±13.26 82.35±6.43ab 145.616＊＊Ⅳ-C（μg/L）72.02±12.72 80.12±15.32a 201.32±30.07ab 707.673＊＊LN（μg/L）64.95±13.08 71.50±16.09a 136.26±28.65ab 149.726＊＊PCⅢ（μg/L）44.02±10.27 49.53±11.02a 163.26±21.18ab 921.650＊＊miR-27b-3p（2-ΔΔCt）3.10±0.69 2.29±0.55a 1.02±0.35ab 166.444＊＊miR-342-3p（2-ΔΔCt）2.81±0.52 2.01±0.34 0.95±0.28ab 249.438＊＊

Tab.4 Univariate Logistic regression analysis of factors affecting the incidence of DN表4影响DN的单因素Logistic回归分析

Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting the incidence of DN表5影响DN的多因素Logistic回归分析

2.5 各指标诊断DN效能分析基于前述Logistic回归结果，建立联合诊断回归预测模型，Log［P/（1-P）］=15.087+0.502×尿PCⅢ-0.842×eGFR-0.559×miR-27b-3p-0.416×miR-342-3p，拟合ROC曲线显示联合诊断DN的AUC为0.948，联合检测效能高于单独eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p（Z分别 为5.631、5.794、6.715、4.577，P＜0.05），见 图1、表6。

Fig.1 ROC graphs of eGFR,PCⅢ,miR-27b-3p and miR-342-3p for diagnosing DN图1 eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p诊断DN的ROC曲线

Tab.6 Efficacy of eGFR,PCⅢmiR-27b-3p and miR-342-3p in diagnosing DN表6 eGFR、尿PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p诊断DN的效能

3 讨论

DN是导致糖尿病患者死亡和残疾的主要原因。目前，DN诊断以UACR、eGFR为主要参考指标，但是UACR、eGFR受感染、发热、心力衰竭等因素影响较大，积极探寻新型DN相关生物学标志物十分必要。目前，已发现DN患者血清和肾组织中部分miRNA异常表达，miRNA可能与DN发病机制密切相关，有望成为DN早期诊断的潜在标志物［12］。miR-27b-3p是与组织纤维化密切相关的miRNA，位于人类19号染色体，在乳腺、肝脏、肾脏等多种器官中广泛表达，miR-27b-3p通过靶向转化生长因子（TGF）-β受体1、Smad等纤维化相关基因表达，从而参与成纤维细胞活化的调节过程，其与多种纤维化相关疾病的发生有关［13］。研究显示，miR-27b在心肌纤维化患者和大鼠梗死心脏组织中表达水平均增加，miR-27b过表达通过抑制含F框及WD重复结构域蛋白7介导的Snail降解，促使胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ和基质金属蛋白酶-9表达，诱导上皮间质转化（EMT），促进心肌细胞增殖和纤维化［14］。miR-27b-3p同样参与视网膜下纤维化进程，miR-27b-3p表达增加可通过靶向调控HOXC6基因，阻断TGF-β/Smad信号通路激活，抑制EMT和视网膜纤维化［15］。miR-27b-3p还 通 过 直 接 靶 向TGF-β受 体1和SMAD2，抑制肺组织成纤维细胞活化［13］。本研究结果显示，DN组、MA组患者血清miR-27b-3p表达较NA组下调，且miR-27b-3p表达与eGFR呈正相关，与尿PCⅢ呈负相关，表明miR-27b-3p表达下调可能导致肾纤维化和肾功能损伤，提示miR-27b-3p可抑制肾纤维化和2型糖尿病患者DN进程，机制可能为miR-27b-3p表达下调而导致其抗纤维化作用减弱，促使肌成纤维细胞活化和增殖，肾小管上皮细胞凋亡及上皮细胞表型转化，导致细胞外基质在肾间质过度积聚，最终导致肾纤维化和DN的发生。体外实验亦显示，miR-27b-3p通过结合信号转导和转录激活因子1（STAT1）的3′-UTR并下调STAT1表达，从而抑制α-平滑肌激动蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和纤维连接蛋白表达，减轻肾纤维化［16］。

miR-342-3p定位于14q32，嵌入其宿主基因Ena/VASP like（EVL）的第三个内含子中，与细胞外基质沉积和TGF-β信号通路均关系密切［17］。miR-342-3p是Notch信号通路的下游分子，通过抑制内皮细胞中的SMAD1/5磷酸化，从而调节血管内皮生长因子和TGF-β表达，参与血管生成和EMT［18］。另外，miR-342-3p还可负向调控Wnt3a表达，从而参与肿瘤细胞的增殖、凋亡过程以及EMT调控过程［19］。TGF-β是肾纤维化的关键介质，主要通过激活其下游Smad信号通路来诱导α-平滑肌激动蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和纤连蛋白表达，促进成纤维细胞活化，增强胶原合成和细胞外基质沉积，最终导致肾纤维化形成［20］。EMT是肌成纤维细胞的主要来源，活化肌成纤维细胞可引起细胞外基质沉积，引起肾间质纤维化［21］。由此推测，miR-342-3p可能与肾纤维化和肾脏疾病有关。本研究结果亦显示，DN组、MA组患者血清miR-342-3p表达较NA组下调，证实了miR-342-3p低表达与肾纤维化和肾功能下降有关。推测miR-342-5p参与DN的机制为：首先，miR-342-5p可通过负向调控Ptch1表达，抑制由TGF-β1诱导的细胞自噬，进而抑制肾纤维化进程［22］；其次，miR-342-3p可靶向抑制SRY盒转录因子6表达，促进肾系膜细胞增殖并抑制其凋亡，抑制高糖诱导的肾间质纤维化［23］。因此，miR-342-3p表达下调可能通过促使肾纤维化，从而导致肾功能损伤和DN发生。

miR-27b-3p、miR-342-3p在DN患者血清中的异常表达可用作DN辅助诊断的参考指标。本研究ROC分析结果显示，miR-27b-3p、miR-342-3p在糖尿病人群中鉴别DN的AUC为0.733、0.652，表明miR-27b-3p、miR-342-3p可鉴别DN的发生，但是单独诊断敏感度和特异度均偏低，尚不能满足诊断DN的需求，联合eGFR、PCⅢ、miR-27b-3p、miR-342-3p指标后AUC明显扩大，表明联合miR-27b-3p、miR-342-3p、eGFR、PCⅢ检测可提高DN的检出率，为临床诊断提供更可靠的参考。

综上，DN、MA患者血清miR-27b-3p、miR-342-3p表达较NA患者均降低，miR-27b-3p、miR-342-3p低表达与肾功能下降、DN发生有关；miR-27b-3p、miR-342-3p表达下调可能通过加速肾纤维化，从而参与DN发病过程。因此，miR-27b-3p、miR-342-3p可作为DN辅助诊断的参考指标。