白藜芦醇通过BRD4调控Wnt/β-catenin通路逆转胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的机制研究

2022-11-02 08:39李振江孙德超孔晨旭耿亚东徐晨阳丁炳谦
天津医药 2022年10期
关键词:细胞株胶质瘤活化

李振江,孙德超,孔晨旭,耿亚东,徐晨阳,丁炳谦

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,恶性度、发病率和复发率较高,预后较差[1]。替莫唑胺(TMZ)是治疗胶质瘤的重要化学药物,但多数患者容易出现TMZ耐药现象[2],故提高其疗效十分重要。Wnt可通过经典及非经典途径调控β-连环素(β-catenin)活性,调节细胞内目的基因表达,参与细胞增殖、迁移、凋亡等生理活动及肿瘤多药耐药性[3]。研究发现,抑制Wnt/β-catenin通路活性可阻断依赖O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的DNA修复途径活化,降低胶质瘤细胞对TMZ的化疗耐药性,因此,Wnt/β-catenin通路有望成为提高胶质瘤TMZ化疗疗效的潜在干预靶点[4]。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)是一种致癌因子,在多种肿瘤中高表达[5]。BRD4在胶质瘤组织中的表达水平与胶质瘤患者的总生存期呈负相关[6]。BRD4高表达可引起Wnt/β-catenin通路活化,抑制或降解BRD4可阻断Wnt/β-catenin通路活化,发挥抗癌作用[6]。由此推测,BRD4可能与Wnt/β-catenin通路存在间接或直接联系。白藜芦醇(resveratrol,RES)为天然多酚类化合物,能通过多种生化作用发挥较为活跃的抗肿瘤作用[7]。RES具有脂溶性,可透过血脑屏障,发挥抗颅内肿瘤生长作用[8]。另外,RES可增强TMZ对脑胶质瘤的治疗作用[9],但其作用机制有待探究。本研究从BRD4及Wnt/β-catenin通路出发,探究RES提高胶质瘤细胞化疗敏感性的机制,为提高胶质瘤化疗效果提供参考。

1 材料与方法

1.1材料清洁级雄性NUDE大鼠20只,42~49日龄,体质量(230±5)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2021-0011。本研究符合3R原则。人神经胶质瘤TMZ低敏细胞株(U138)、耐药株(T98G)购自ATCC;高敏细胞株(U251)购自中国科学院细胞资源中心;注射用TMZ购自江苏恒瑞医药公司;RES、DMEM培养基购自Sigma公司;BRD4抑制剂JQ1购自MCE公司;Wnt3a/βcatenin通路激活剂LiCl购自Selleck公司;BRD4过表达质粒pcDNA BRD4及阴性对照质粒pcDNA NC由上海吉玛基因公司合成;兔抗人BRD4、Wnt3a、β-catenin、Ki67抗体,小鼠抗人TMZ耐药蛋白(MGMT)、内参β-actin抗体及羊抗兔或羊抗小鼠二抗购自Abcam公司;CCK-8试剂、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京诺唯赞生物公司;酶标仪(型号:MultiskanTMFC)购自Thermo公司;流式细胞仪(型号:FACSCanto II)购自BD公司;凝胶成像系统(型号:Tanon 1600/1600R)购自Tanon公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组处理取适量U138、U251、T98G细胞37℃水浴复苏后,于DMEM培养基(含10%胎牛血清)和恒温培养箱中传代培养、计数。取对数生长期T98G细胞,按1×106个/孔接种于6孔板内,进行如下处理:(1)不同浓度(0、5、10、50、100、200 μmoL/L)RES和不同浓度(0、10、50、100、200、400 μmoL/L)TMZ单独培养,72 h后测定增殖活性,选择50 μmoL/L RES及100 μmoL/L TMZ进行后续实验。(2)设置对照1组(添加100 μmoL/L TMZ)、RES1组(添加50 μmoL/L RES)、RES+TMZ(同时添加100 μmoL/L TMZ和50 μmoL/L RES)组,培养72 h,另用CCK-8法绘制生长曲线并计算RES存在或不存在时细胞对TMZ的耐药指数,耐药指数=添加RES时半数抑制浓度(IC50)/未添加RES时IC50。(3)在添加100 μmoL/L TMZ的基础上,对T98G细胞转染pcDNA BRD4(或pcDNA NC)或加入50 μmoL/L RES2,分别作为pcDNA NC组、pcDNA BRD4组、RES2组、RES+pcDNA BRD4组。(4)参照文献[10]和[11]在添加100 μmoL/L TMZ的基础上加入250 nmoL/L JQ1或40 μmoL/L LiCl,依次作为对照2组、JQ1组、JQ1+LiCl组。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖取培养72 h的各组细胞,加入10 μL的CCK-8溶液干预培养4 h,读取酶标仪450 nm波长处光密度(OD)值。根据OD值绘制生长曲线。细胞增殖活性(%)=(OD药物-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡各组细胞培养72 h,取细胞,PBS洗涤、4℃加入75%冷乙醇固定过夜,PBS洗涤重悬细胞后顺次加入Annexin V-FITC染色液、PI染液,混匀后4℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.4Western blot检测蛋白表达取对数生长期U138、U251、T98G细胞粉碎匀浆后,提取蛋白并测定浓度,取蛋白100 μg行上样、电泳及转膜操作,滴加1∶800的一抗(BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT)及1∶900的β-actin抗体孵育过夜,二抗孵育50 min,化学发光法显影曝光,凝胶成像系统拍照并计算条带相对灰度值,以目的蛋白与内参蛋白的比值计算蛋白相对表达水平。

1.2.5裸鼠成瘤验证RES的作用裸鼠麻醉后,向左侧肩胛区皮下注射200 μL(1×106个细胞)T98G单细胞悬液,无菌条件下饲养12 d,注射部位有明显瘤块突起为成瘤成功[9]。按随机数字表法将裸鼠分为对照治疗组、TMZ治疗组、RES+TMZ治疗组、RES+TMZ+JQ1治疗组,每组5只,对照治疗组腹腔注射DMSO溶液,TMZ治疗组腹腔注射50 mg/kg TMZ,RES+TMZ组在TMZ治疗的基础上,腹腔注射40 mg/kg RES治疗[9],RES+TMZ+JQ1组在RES+TMZ治疗的基础上给予1 mg/kg JQ1[10]腹腔注射治疗。1次/d,连续给药30 d后处死大鼠。取瘤体,4%多聚甲醛固定,制成5 μm的石蜡切片,脱蜡、水化、H2O2处理后,加入1∶200的一抗Ki67抗体孵育过夜,二抗孵育1 h,DAB显色,置于光镜下观察拍照。Image J软件计算单位面积内Ki67阳性染色的OD值。另用Western blot法检测瘤体中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达。

1.3统计学方法采用SPSS 24.0软件分析数据,符合正态分布的数据用±s表示,2组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMZ不同 敏 感 细胞株中BRD4、Wnt3a、βcatenin及MGMT蛋白表达变化比较与U251细胞相 比,U138、T98G的BRD4、Wnt3a、β-catenin及MGMT表达依次升高(P<0.05),见图1、表1。

Fig.1 Immunoblot of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in different sensitive cell lines of TMZ图1 TMZ不同敏感细胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图

Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感细胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 (n=6,±s)

Tab.1 Comparison of protein expressions of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT between different sensitive cell lines of TMZ表1 TMZ不同敏感细胞株中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 (n=6,±s)

**P<0.01;aU251相比,b与U138相比,P<0.05。

细胞系U251 U138 T98G F BRD4 0.38±0.06 0.91±0.11a 1.85±0.21ab 166.826**Wnt3a 0.42±0.07 1.23±0.13a 2.09±0.28ab 125.287**β-catenin 0.26±0.05 1.52±0.14a 2.17±0.26ab 189.237**MGMT 0.63±0.07 1.78±0.12a 2.69±0.24ab 249.449**

2.2 RES对T98G细胞增殖、凋亡、耐药性、BRD4及Wnt3a/β-catenin通路的影响0、5、10、50、100、200 μmoL/L RES单独处理T98G细胞72 h,当其浓度为5~50 μmoL/L时,细胞增殖活性下降,并在50~200 μmoL/L时保持稳定,见图2。选择50 μmoL/L RES进行后续实验。

Fig.2 Effects of different concentrations of RES on the proliferation activity of T98G cells图2不同浓度RES对T98G细胞增殖活性的影响

0、10 、50、100、200、400 μmoL/L TMZ单独处理T98G细胞72 h,当浓度为10~100 μmoL/L时,细胞增殖活性下降,并在100~400 μmoL/L时保持稳定,见图3。选择100 μmoL/L TMZ进行后续实验。

Fig.3 The effect of different concentrations of TMZ on the proliferation activity of T98G cells图3不同浓度TMZ对T98G细胞增殖活性的影响

与对照1组相比,RES1组、RES+TMZ组T98G细胞凋亡率依次升高,BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达及细胞增殖活性依次降低(P<0.05),见图4、5,表2。

Fig.4 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells in each group图4各组T98G细胞流式凋亡图

Fig.5 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin,MGMT protein expression图5 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图

Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES对T98G细胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的影响(n=6,±s)

Tab.2 Effects of RES on the proliferation activity,apoptosis rate and protein expression of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT in T98G cells表2 RES对T98G细胞增殖活性、凋亡率及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的影响(n=6,±s)

**P<0.01;a与对照1组相比,b与RES1组相比,P<0.05。

组别对照1组RES1组RES+TMZ组F增殖活性(%)100.00±5.06 51.19±6.71a 25.47±2.63ab 332.660**凋亡率(%)9.14±2.13 23.19±4.08a 45.36±6.52ab 94.239**BRD4 1.78±0.19 1.36±0.27a 0.74±0.12b 39.929**组别对照1组RES1组RES+TMZ组F Wnt3a 1.32±0.18 0.93±0.16a 0.42±0.11b 52.305**β-catenin 1.86±0.33 1.47±0.12a 0.65±0.18b 44.096**MGMT 2.19±0.48 1.68±0.23a 1.04±0.13b 19.909**

生 长 曲 线 见 图6,RES干 预 时,T98G细 胞TMZIC50、耐药指数分别为(53.47±5.40)μmoL/L、0.53±0.05,显著低于无RES时的(100.08±9.14)μmoL/L、1.00±0.08(tTMZIC50=10.755,t耐药指数=12.203,均P<0.05)。

2.3 过表达BRD4可减弱RES对T98G细胞TMZ耐药性的逆转作用与pcDNA NC组相比,pcDNA BRD4组T98G细胞BRD4蛋白表达升高(P<0.05),见图7、表3。与pcDNA NC组相比,pcDNA BRD4组T98G细胞Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达及增殖活性升高,凋亡率降低(P<0.05);与RES2组相比,RES+pcDNA BRD4组Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达及增殖活性升高,凋亡率降低(P<0.05),见图7、8,表3。

Fig.6 The effect of RES on TMZIC50 in T98G cells图6 RES对T98G细胞TMZIC50的影响

Fig.7 Western blot assay of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression图7 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图

2.4 BRD4对Wnt3a/β-catenin通路的影响相比对照2组,JQ1组增殖活性及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达水平降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05)。与JQ1组相比,JQ1+LiCl组增殖活性、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达升高,凋亡率降低(P<0.05),见图9、10,表4。

2.5 RES的体内实验验证结果与对照治疗组相比,TMZ治疗组瘤 体 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与TMZ治疗组相比,RES+TMZ治疗组、RES+TMZ+JQ1治疗 组瘤 体 中Ki67、BRD4、Wnt3a、βcatenin、MGMT蛋白表达降低(P<0.05),且RES+TMZ+JQ1组瘤体中Ki67及BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达最低(P<0.05),见图11、12,表5。

3 讨论

Fig.8 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells图8 T98G细胞流式凋亡图

Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各组细胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 (n=6,±s)

Tab.3 Comparison of cell proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the four groups表3各组细胞增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 (n=6,±s)

**P<0.01;a与pcDNA NC组相比,b与pcDNA BRD4组相比,c与RES2组相比,P<0.05。

组别pcDNA NC组pcDNA BRD4组RES2组RES+pcDNA BRD4组F增殖活性(%)100.02±6.18 160.73±15.02a 51.23±6.84a 93.42±7.15bc 134.977**凋亡率(%)9.16±1.09 2.74±0.16a 22.36±5.07a 13.75±1.26bc 57.308**BRD4 1.78±0.19 2.53±0.26a 1.32±0.28a 1.96±0.41 17.162**Wnt3a 1.32±0.18 2.45±0.31a 0.92±0.25a 1.76±0.19bc 45.382**β-catenin 1.86±0.33 2.84±0.37a 1.42±0.18a 2.15±0.37bc 20.542**MGMT 2.07±0.38 2.95±0.41a 1.57±0.15a 2.51±0.17bc 23.081**

Fig.9 Flow cytometry chart of apoptosis of T98G cells图9 T98G细胞流式凋亡图

Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各组增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的比较 (n=6,±s)

Tab.4 Comparison of proliferation activity,apoptosis rate,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression between the three groups表4各组增殖活性、凋亡率、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达的比较 (n=6,±s)

**P<0.01;a与对照2组相比,b与JQ1组相比,P<0.05。

组别对照2组JQ1组JQ1+LiCl组F增殖活性(%)100.00±6.43 51.19±7.42a 98.23±7.51b 92.280**凋亡率(%)11.43±3.15 29.15±3.87a 13.46±3.21b 48.089**BRD4 1.69±0.13 1.28±0.17a 1.25±0.19 13.282**Wnt3a 1.31±0.19 0.89±0.07a 1.25±0.09b 18.916**β-catenin 1.84±0.32 1.36±0.17a 1.79±0.12b 8.603**MGMT 2.15±0.23 1.82±0.09a 2.09±0.11b 7.609**

胶质瘤占脑部肿瘤的半数以上,是神经外科最难治疗的肿瘤[12]。TMZ是临床治疗胶质瘤的有效药物,但有48%~58%的患者对TMZ化疗不敏感[13],故探寻胶质瘤化疗耐药的分子机制对提高TMZ化疗效果有重要意义。

TMZ可通过甲基化DNA分子并使DNA在复制过程中出现碱基错配,引起DNA链断裂、损伤,发挥细胞毒性作用[14]。但MGMT表达升高后可转移鸟嘌呤上的烷化基团,阻断DNA损伤,介导耐药性产生[15]。如何干预MGMT表达已成为提高胶质瘤TMZ化疗敏感性的重要研究方向。有研究发现,Wnt/β-catenin通路活化是引起MGMT抗药修复系统激活的关键原因[16]。Wnt通路被激活时,Wnt与相关受体结合后会促进细胞质中β-catenin进入细胞核,调节增殖、生长及耐药蛋白如P-糖蛋白等基因转录,介导多重耐药[17]。此外,Wnt/β-catenin通路已被认为参与MGMT的转录调控过程[18]。本研究发现,高敏株、低敏株、耐药株中的MGMT及Wnt/βcatenin通路蛋白表达依次升高,提示Wnt3a/βcatenin通路活化与胶质瘤TMZ耐药密切相关。但引起Wnt3a/β-catenin通路活化的上游调控机制还不明确。

Fig.10 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression图10 BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图

Fig.11 Immunohistochemical staining showing Ki67 in tumor图11瘤体内Ki67免疫组化染色图(标尺:50 μm)

Fig.12 Immunoblot results of BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expression in tumor图12瘤体中BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达免疫印迹图

Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤体中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 (n=5,±s)

Tab.5 Comparison of Ki67,BRD4,Wnt3a,β-catenin and MGMT protein expressions in tumors between the four groups表5瘤体中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达比较 (n=5,±s)

**P<0.01;a与TMZ治疗组相比,b与RES+TMZ组相比,P<0.05。

组别对照治疗组TMZ治疗组RES+TMZ治疗组RES+TMZ+JQ1治疗组F Ki67(光密度/mm2)2.13±0.18 2.10±0.21 1.47±0.13a 0.85±0.09ab 72.557**BRD4 1.57±0.10 1.53±0.12 1.18±0.15a 0.61±0.11ab 66.924**Wnt3a 1.83±0.14 1.82±0.18 1.27±0.12a 0.53±0.06ab 107.569**β-catenin 1.25±0.16 1.23±0.15 0.96±0.12a 0.48±0.07ab 38.160**MGMT 2.13±0.17 2.10±0.14 1.71±0.19a 1.06±0.12ab 50.141**

BRD4可间接或直接引起Wnt3a/β-catenin通路活化而发挥致癌及促癌作用。BRD4能驱动原癌基因(C-MYC)、凋亡调节因子(BCL-2)、程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)等关键致癌基因转录,加速肿瘤发展,还可激活DNA损伤检查点来修复损伤DNA,提高癌细胞防御外界损伤的能力[19]。另外,BRD4能够通过调节miR-142-5p、miR-216-3p等的表达,进而影响其靶基因Wnt3a表达,促进Wnt/β-catenin通路活化,参与癌症的发展[6,20]。本研究发现,高敏株、低敏株、耐药株中的BRD4表达也逐渐升高。使用BRD4抑制剂JQ1可显著抑制BRD4表达,同时抑制T98G细胞增殖及Wnt3a/β-catenin、MGMT蛋白表达,促进其凋亡,提高其对TMZ化疗的敏感性;反之,Wnt/β-catenin通路激活剂可减弱JQ1的上述作用,提示BRD4可调控Wnt3a/β-catenin通路活化,参与胶质瘤TMZ耐药。

RES具有抗氧化、抗炎、促进自噬、调控线粒体呼吸功能等作用[21]。研究发现,RES还能与顺铂、TMZ等化疗药物协同作用,降低化疗药物诱导细胞死亡的阈值,提高化疗效果[7,9]。本研究也发现,RES在提高胶质瘤对TMZ化疗敏感性的同时,还可抑 制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表 达,且BRD4高表达可明显减弱RES对T98G细胞TMZ耐药性的逆转作用,提示RES对T98G细胞TMZ耐药性的逆转作用可能与抑制BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT表达有关。另外,体内实验也发现,与TMZ治疗相比,RES+TMZ治疗组、RES+TMZ+JQ1治疗组瘤体中Ki67、BRD4、Wnt3a、β-catenin、MGMT蛋白表达降低,提示RES可激活TMZ对瘤体内Wnt3a/βcatenin通路、MGMT表达和细胞增殖的抑制作用,JQ1可加强上述作用。

综上所述,RES可能通过下调BRD4,进而抑制Wnt3a/β-catenin通路活化,实现对胶质瘤T98G细胞TMZ耐药性的逆转。本研究为阐明胶质瘤TMZ化疗耐药性产生的分子机制提供了一定参考,也为治疗胶质瘤提供了新的化疗思路。但BRD4、Wnt3a/β-catenin及MGMT之间的靶向关系仍需继续探究。

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