限制性因子黏液病毒抗性蛋白Ⅱ对乙型肝炎病毒复制的影响*

代 娟，胡 杰，彭 胡

1.重庆市九龙坡区中医院 检验科（重庆 400080）；2.重庆医科大学（重庆 400016）；3.泸州市中医医院 检验科（泸州 646000）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是重要的全球健康问题之一。据世界卫生组织统计，大约有20亿人感染HBV，其中有2.92亿患者为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），每年大约有88.4万HBV患者死于HBV疾病或其并发症，如肝癌、肝硬化[1]。尽管有预防性重组疫苗，但每年仍有约 3 000 万人新发感染HBV[1]。目前治疗CHB获批的药物有Ⅰ型干扰素 （interferon，IFN） 和5种核苷（酸） 类 似 物 （nucleotide analogs，NAs）[2]。NAs能 抑 制HBV复制的逆转录过程，但很难降低血清中的乙肝表面抗原（HBsAg）水平[3]，患者需终身治疗。IFN虽然仅适用于小部分患者，但在有限时间（通常为48周）治疗后，可持续抑制HBV的复制[4-5]，目前已经鉴定出数百种具有抗病毒作用和免疫反应调节功能的IFN刺激基因[6-7]。

黏液病毒抗性蛋白 （myxovirus resistance proteins，MX） 在先天免疫防御中发挥重要作用，具有抗病毒 活性作用[8-10]。MX属于IFN诱导型GTP酶超家族[11-12]， 在脊椎动物中高度保守[13]。人类有2个mx基因，即mx1、mx2，分 别 编 码MX1（又 称MXA）、MX2（又 称MXB）蛋白[14]。MX1具有广谱抗病毒活性，且主要针对RNA病毒[10]。MX2是一种受IFN诱导的能抑制人类I型免疫缺陷性病毒 （human immunodeficiency virus-1，HIV-1）、丙型病毒性肝炎（hepatitis c virus，HCV）和 疱 疹 病 毒（herpes simplex virus-1，HSV-1）感染的病毒限制性因子[15-20]。然而在肝癌HepG2细胞、含有牛磺胆酸钠协同转运肽（sodium taurocholate cotransporting peptide，NTCP）的HepG2细胞（简称HepG2-NTCP细胞）中，MX2对HBV的复制作用报道较少。因此，本研究拟利用IFNα诱导MX2表达，探索MX2对HBV复制的影响，为临床治疗HBV提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HepAD38细 胞、HBV过表达质粒pCH9/3091 genetype D （gtD）由重庆医科大学实验室保存；肝癌HepG2细 胞、HepG2-NTCP细 胞 购 自 美 国ATCC公司；胎牛血清购自美国Corning公司；DMEM培养基、青-链霉素购自美国Hyclone公司；opti-MEM购自美国Gibco公司；IFNα购自美国Proteintech公司；逆转录试剂盒购自日本Takara公司；MX2抗体购自美国Abcam公司；HA抗体购自美国Thermo Fisher Scientific公司；蛋白maker、ECL发光底物购自美国Bio-rad公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自成都生工公司；GAPDH抗体购自上海碧云天公司；β-ACTIN和鼠、兔来源二抗购自北京中杉金桥公司；HBcAg抗体购自丹麦Dako公司；DIG探针标记检测试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、Nylon膜、cocktail抑制剂购自美国Roche公司；Lipo3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；胶片、显影液、定影液购自美国柯达公司；mx2的qPCR引物在重庆擎科生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建和细胞培养mx2表达质粒是由cDNA序 列（NM_002463.2）克 隆 到pcDNA3.1载 体上，羧基端带有HA标签； 用1%青-链霉素、10%胎牛血清的达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）培养基培养HepG2、HepG2-NTCP细胞，培养条件为4℃、5% CO2；按照Lipo3000转染试剂说明书转染过表达质粒或者siRNA。

1.2.2 荧光定量PCR检测HepG2、HepG2-NTCP细胞接种至6孔板中，通过不同浓度IFNα（0、100、1 000 U/mL）诱导处理2 d后，用TRIzol法提取细胞总mRNA[21]，42℃消化去除基因组DNA，逆转录为cDNA，通过SYBR荧光染料进行荧光定量PCR[22]，Bio-rad CFX荧光定量PCR仪检测mx2mRNA水平，HBV 前基因组RNA （pregenomic RNA，pgRNA）水平或者HBV DNA水平，采用2-ΔΔCt法，以actin作为内参，计算mx2mRNA或HBV pgRNA的变化情况；采用绝对定量检测HBV DNA水平：首先加入SYBR荧光染料5 μL，无酶水2 μL，HBV DNA定量上、下游引物0.5 μL，复制中间体样本 2 μL，使用HBV 1.1倍体pCH9/3091 gtD作为标准品，使用浓度为4×107、4×106、4×105、4×104、4×103、4×102拷贝/μL，10倍稀释。使用Bio-rad CFX荧光定量PCR仪进行扩增并检测荧光信号，从而检测HBV DNA水平。

1.2.3 蛋白质印迹技术检测HepG2、HepG2-NTCP细胞通过IFNα诱导、mx2siRNA干扰以及过表达mx2处理相应天数后，用RIPA（含10% cocktail）裂解液裂解细胞，提取蛋白，蛋白上样量为30 μg。10% SDS-PAGE电泳分离后，恒流转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗涤后分别加入MX2、HA及β-ACTIN抗体，于4 ℃摇床孵育过夜。第2天TBST洗涤4次，8 min/次，然后加入山羊抗兔或山羊抗小鼠的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤4次，8 min/次，最后采用ECL进行荧光显色，柯达胶片显影。

1.2.4 HBV病毒颗粒收集HepAD38细胞上清收集至50 mL离心管，4 000 r/min，离心半径17 cm，离心5 min，去除细胞碎片，使用0.45 μm的过滤器进一步除去细胞碎片，然后加入已经过滤除菌的PEG8000使其终浓度为5%，富集上清中的HBV病毒颗粒，4 ℃摇床过夜，4 000 r/min，离心半径17 cm，4 ℃ 离心30 min，弃掉上清，使用opti-MEM溶解后，取10 μL用于测定HBV病毒滴度。

1.2.5 HBV病 毒 颗 粒 感 染HepG2-NTCP细 胞将HepG2-NTCP细胞接种至6孔板，细胞贴壁后加入DMSO处理12 h；接着加入HBV病毒颗粒（病毒基因当量为500）进行感染，感染24 h后，更换新鲜培养液继续培养，以待进行蛋白收集、复制中间体提取等处理[23]。

1.2.6 HBV病毒核心颗粒DNA提取采用蔗糖密度梯度离心法提取HBV病毒核心颗粒中的DNA[24]：细胞在处理3～5 d后，PBS洗涤2次，用核心制备裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），1% NP-40，2%蔗糖）常温裂解15～20 min，转移至1.5 mL无酶EP管，12 000 r/min，离心半径8 cm，离心5 min，上清液转移至新的1.5 mL EP管，用微管酶37 ℃水浴消化1 h，去除外源DNA，然后在30%蔗糖密度介质中，45 000 r/min，离心半径11 cm，4 ℃超速离心2 h，提取病毒颗粒，蛋白酶K消化得到病毒颗粒，通过酚/氯仿/异戊醇抽提，并用乙醇沉淀得到HBV DNA。

1.2.7 DNA印迹技术检测配制1.2%琼脂糖凝胶，120 V恒压电泳1 h，随后碱变性使DNA成单链，中和后使用SSC转膜至Nylon膜上，紫外交联固定DNA后，采用预杂交液反应1 h，使用地高辛标记的DNA杂交液过夜，反复多次洗膜，使用blocking液封闭，与地高辛抗体反应后显影[23]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，定量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 IFNα对MX2 蛋白的作用

与对照组比较，经1 000 U/mL的IFNα处理后，HepG2、HepG2-NTCP细胞的MX2蛋白及mRNA水平均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1、表1～2）。

图1 经IFNα处理后，MX2蛋白在不同肝癌细胞中的表达

表1 IFNα对MX2 蛋白的作用（ ，n=3）

表2 IFNα对mx2 mRNA的作用（ ，n=3）

2.2 过表达mx2对HBV DNA复制的影响

与对照组比较，HepG2细胞中过表达0、1、2 μg的HA-mx2后，DNA印迹技术检测结果显示，HBV DNA复制水平呈现梯度依赖性降低；同时蛋白质印迹技术检测结果显示，过表达HA-mx2后，HBcAg蛋白水平也呈现浓度依赖性降低；与对照组比较，在HepG2-NTCP细胞中过表达梯度的HA-mx2后，qPCR检测HBV DNA复制水平呈现梯度依赖性降低（P＜0.05）（图2、表3）。

表3 过表达mx2对HepG2-NTCP细胞HBV DNA的影响（ ，n=3）

图2 过表达mx2对HBV的影响

2.3 过表达mx 2后对HBV pgRNA表达的影响

与对照组比较，在HepG2细胞中过表达梯度的HA-mx2后，qPCR检测结果显示，HBV pgRNA的水平呈现梯度依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，在HepG2-NTCP细胞中过表达梯度的HA-mx2后，HBV pgRNA的水平呈现梯度依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

表4 过表达mx2对HBV pgRNA表达的影响（ ，n=3）

2.4 siRNA敲低mx2后对HBV DNA复制的影响

与siNC组比较，在HepG2细胞中干扰内源性mx2后，HBV DNA复制水平及HBcAg蛋白水平明显升高；qPCR检测结果显示，与siNC组比较，在HepG2-NTCP细胞中干扰内源性mx2后，HBV DNA复制水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3、表5）。

图3 siRNA敲低mx2后对HBV DNA的影响

表5 敲低mx2对HepG2-NTCP细胞HBV DNA的影响（ ，n=3）

3 讨论

HBV或HCV病毒可导致病毒性肝炎，严重时可引发患者死亡[25-26]。HCV 在其抗病毒药物出现后便可治愈[27]。CHB在病理生理学及临床治疗方面均取得巨大进展。现阶段可通过抑制HBV病毒复制，从而防止肝病纤维化进展，对有活动性炎症和/或 HBV DNA 水平升高和/或肝损伤的患者进行治疗，以提高患者生活质量和生存率[28]。NAs对HBV病毒具有抑制作用，但CHB患者还不能实现功能性治愈。HBV病毒可通过补充具有半衰期长和完整病毒DNA形式的共价闭合环状 DNA （covalently closed circular DNA ，cccDNA）持续存在于肝细胞核中。

NTCP已被证明是HBV进入肝细胞的功能性受体[29]，因此靶向病毒进入受体的新药可作为预防未感染肝细胞的潜在药物。布勒韦肽是从HBV 前S1结构域中获得的合成脂肽，当布勒韦肽与NTCP结合时，可有效阻止HBV在肝细胞中扩散，并阻碍受感染肝细胞中cccDNA池扩增[30-31]。

MX2可有效抑制HIV-1 的早期感染[7，15-17]。研究[16]表明， MX2 是Ⅰ型 IFN 抗 HIV-1 活性的效应物， MX2 通过抑制亚病毒复合物的衣壳依赖性入核来抑制 HIV-1、HCV[18]及HSV-1[19-20]感染。本研究发现，在HepG2和HepG2-NTCP细胞中，IFNα可诱导MX2蛋白和RNA水平升高，这与相关研究[15-16]结果一致。本研究还发现，在HepG2和HepG2-NTCP细胞中过表达HA-mx2后，HBV DNA复制和HBV pgRNA水平均呈梯度依赖性降低；与siNC组比较，使用小干扰RNA特异性敲低内源性mx2的表达后，其蛋白水平明显降低，但是HBV DNA复制水平明显升高。该结果与Wang等[32]研究结果一致，表明MX2能抑制HBV的复制。

综上所述，Ⅰ型IFNα可诱导MX2蛋白和mRNA表达上调，且MX2在HepG2和HepG2-NTCP肝癌细胞中能抑制HBV DNA的复制。本研究不足之处在于未检测细胞cccDNA水平，可在后续研究中验证此HBV指标，以确定MX2是否可通过降低HBV的cccDNA水平来调控HBV的复制。