κ-阿片受体激动剂对高尿酸血症大鼠血管内皮细胞功能的影响及机制研究*

郑 琴，杨 红，陈秋宏，李晓慧，金家贵，吴 奇△

1.成都医学院第一附属医院 全科医学科（成都 610500）；2.成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院 心血管内科（成都 610057） 3.成都医学院第一附属医院 心血管内科（成都 610500）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是由嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少所引起的一种异质性疾病，以血尿酸升高为主要特征。近年来，随着人们生活水平的提高和膳食模式的改变，HUA发病趋势日益增高，目前我国HUA的总体患病率为13.3%[1]。HUA与心血管疾病、慢性肾脏疾病的风险存在独立相关性，是心血管事件和全因病死率的独立预测因子[2-4]。高浓度尿酸盐可引起血管内膜发生急、慢性炎症损伤[5]。有研究[6-7]发现，HUA患者的内皮细胞依赖性血管扩张功能明显受损，损伤程度与血清尿酸水平呈正相关。研究[8]发现，当κ-阿片受体（κ-opioid receptor，κ-OR）激活后，对炎症反应损伤的心肌及血管具有保护作用，但κ-OR激动剂是否能减轻HUA 对血管内皮细胞的损伤尚不清楚。因此，本研究拟利用HUA大鼠模型及其内皮细胞模型探讨κ-OR激动剂U50488H对HUA大鼠血管内皮细胞功能的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康SD成年大鼠30只，体重为（250±30） g，雄性，由成都医学院实验动物中心提供，本研究遵循动物伦理要求，并经成都医学院伦理委员会审核、批准，实验操作符合关于善待实验动物指导性的意见要求。

1.2 试剂及仪器

内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗体和蛋白激酶 B （protein kinase B，AKT）抗体（美国，R&D Systems公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（杭州联科生物公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）、内皮素-1（endothelin 1，ET-1）、 肿 瘤 坏 死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 、 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒及细胞裂解液（福建睿信生物公司）；ECL试剂盒（上海碧云天生物公司）；eNOS抑制剂（L-NAME，美国密苏里州西格玛公司）；U50488H、κ-阿片受体阻断剂（nor-binaltorphimine，Nor-BNI）及AKT抑制剂（美国，马里兰州国家药物滥用研究所）；酶标仪（美国，Biotek PowerWave-XS公司）；ChemiDocTM XRS化学发光凝胶成像分析系统及电泳仪（美国，Bio-Rad公司）。

1.3 HUA模型的建立与分组

1.3.1 HUA大鼠模型将30只正常成年雄性SD大鼠随机分为Control组、HUA组、HUA+U50488H组，每组10只。Control组给予正常饮食饮水；HUA组和HUA+U50488H组给予氧嗪酸钾灌胃制作HUA大鼠模型[9]（3周后抽其血清检测尿酸升高2～3倍即认为造模成功）；HUA+U50488H组大鼠每日腹腔注射 1.25 mg/kg （0.1 mL） U50488H，其余两组大鼠则每日腹腔注射等量生理盐水（0.1 mL）。干预1周后抽取3组 大鼠尾静脉血，将其血清进行ELISA检测。

1.3.2 HUA细胞模型将Control组大鼠主动脉及Control组和HUA组大鼠血清取出，正常大鼠主动脉翻转进行消化血管内膜，培养及鉴定血管内皮细胞，将培养的内皮细胞分为6组，Control组（50%正常大鼠血清）、HUA组（50%HUA大鼠血清）、HUA+ U50488H组（50%HUA大 鼠血清+70 μmol/L的U50488H）、HUA+U50488H + Nor-BNI组（50%HUA大鼠血清+70 μmol/L U50488H+2.0 mg/kg Nor-BNI）、HUA+U50488H+ AKT 抑制剂组（50%HUA大鼠血清+70 μmol/L U50488H+0.05 mol/L AKT抑 制 剂）和HUA+U50488H+ L-NAME组（50%HUA大鼠血清+ 70 μmol/L U50488H+0.1 mol/L L-NAME），取6组细胞培养液上清液进行ELISA检测，并将前3组细胞液进行蛋白质印迹技术检测。

1.4 ELISA检测NO、ET-1及TNF-α的含量

取3组大鼠血清及6组内皮细胞上清液，稀释5倍后作为ELISA检测样品。在NO、ET-1及TNF-α ELISA试剂盒微孔中分别加入50 μL各检测样品，在样品孔中加入25 μL辣根过氧化物酶标记的链亲和素充分混匀。将包被微孔板覆膜孵育反应60 min后冲洗5次，每孔依次加入TMBⅠ 50 μL、TMBⅡ 50 μL混匀，室温下避光反应20 min，加入终止液终止反应。使用酶标仪在450 nm波长下读取各孔吸光度值，根据吸光度值和标准曲线公式得到样品检测物浓度，从而计算出血清或细胞上清液中检测物浓度。

1.5 蛋白质印迹技术检测内皮细胞eNOS、AKT的表达

在培养的血管内皮细胞中加入细胞裂解液，离心取上清液样品；配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，按蛋白定量浓度进行上样、电泳及转膜；转膜后的PVDF膜置于100 g/L脱脂牛奶中封闭孵育1 h；将目的条带置于相应的一抗（1∶1 000）中孵育过夜，次日在二抗（1∶4 000）中孵育2 h，在膜上滴加ECL检测液；于ChemiDocTM XRS化学发光凝胶成像分析系统上进行分析并记录，条带灰度值采用Quantity one软件分析。

1.6 统计学方法

使用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析，采用 Graph-Pad Prism 8.0进行绘图，定量资料以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验，检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠血清NO、ET-1及TNF-α表达水平比较

与Control组 相 比，HUA组 大 鼠 血 清 中NO及ET-1水平明显降低（P＜0.05），TNF-α水平明显升高 （P＜0.05）；与HUA组相比，HUA+U50488H组大鼠血清中NO及ET-1水平明显升高（P＜0.05），TNF-α水平明显降低（P＜0.05）（表1）。

表1 3组大鼠血清NO、ET-1及TNF-α表达水平比较（ ，n=10）

2.2 3组血管内皮细胞eNOS/AKT通路蛋白表达比较

蛋白质印迹技术结果显示，与Control组相比，HUA组血管内皮细胞eNOS和AKT蛋白表达明显降 低（P＜0.05）。与HUA组 相 比，HUA+U50488H组血管内皮细胞eNOS和AKT蛋白表达明显升高 （P＜0.05）（图1、表2）。

图1 3组血管内皮细胞的eNOS、AKT蛋白表达

表2 3组血管内皮细胞eNOS、AKT蛋白表达比较（ ，n=3）

2.3 6组血管内皮细胞NO、ET-1及TNF-α水平比较

与Control组相 比，HUA组、HUA+U50488H+ Nor-BNI组、HUA+U50488H+ AKT 抑制剂组和 HUA+U50488H+ L-NAME组 细 胞 中NO、ET-1的 含量明显降低，TNF-α的含量明显上升（P＜0.05）。与HUA组相比， HUA+U50488H组血管内皮细胞中NO、ET的含量明显升高（P＜0.05），TNF-α的含量明显降低（P＜0.05）（表3）。

表3 6组内皮细胞NO、ET-1及TNF-α表达水平比较（ ，n=3）

3 讨论

尿酸是由嘌呤在黄嘌呤氧化酶的氧化下产生的最终代谢产物[10]。研究[11]发现，黄嘌呤氧化还原酶抑制剂（如别嘌呤醇和氧嘌呤醇）可改善内皮功能，预防动脉粥样硬化。研究[12-13]报道，尿酸与心血管事件密切相关，是心血管相关疾病的独立危险因素。Zhen等[14]通过体外细胞实验发现，高尿酸可抑制内皮细胞NO释放并促进炎症细胞因子白细胞介素（interleukin，IL）-6、 IL-8和TNF-α的表达，从而引起内皮细胞损伤和血管功能障碍。研究[15]发现，儿茶素可通过阿片受体/NO介导改善血管炎症反应并保护心脏作用。阿片受体是一种G蛋白耦联受体，在心血管系统中其主要亚型是κ-OR。研究[16-17]表明，κ-OR激动剂可激活蛋白激酶C（PKC）、开放K（ATP）通道并减轻Ca2+的过载，从而对缺血缺氧心肌起保护作用。研究[18]表明，激活κ-OR通过PI3K/AKT/eNOS信号通路抑制棕榈酸钠诱导细胞凋亡，然而激活κ-OR对HUA大鼠血管内皮细胞功能的具体作用机制尚不清楚。本研究主要利用HUA大鼠模型及其内皮细胞模型探讨U50488H对HUA大鼠血管内皮细胞功能的影响及机制。

本研究发现，HUA大鼠血清中NO、ET-1表达下调，炎症因子TNF-α表达上调；而经U50488H处理的HUA大 鼠NO和ET-1表 达 上 调，TNF-α表 达 下 调。该结果提示，尿酸可引起血管内皮细胞功能受损，并伴有炎症反应，而U50488H可逆转HUA大鼠的内皮细胞损伤。本研究中体外细胞实验发现，U50488H可明显改善尿酸对内皮细胞功能抑制及血管炎症反应，与体内实验结果一致。

血管内皮细胞的完整性可由多种丝裂原激活蛋白激酶信号通路共同介导，其中eNOS/AKT信号通路在维持血管内皮细胞的完整性和功能中起重要作用[19]。Tian等[20]研究发现，κ-OR激动剂可通过激活PI3K/AKT信号通路改善高脂血症大鼠内皮细胞功能，与本研究结果一致。本研究HUA大鼠血清孵育内皮细胞eNOS和AKT的表达水平明显下降；而与HUA组相比，HUA+U50488H组中eNOS和AKT的表达水平明显上升；因此推测尿酸可抑制内皮细胞eNOS/AKT信号通路，而U50488H激活κ-OR则可逆转这一作用。本研究进一步使用Nor-BNI、AKT 抑制剂及L-NAME联合U50488H 处理HUA大鼠血清孵育的血管内皮细胞，发现内皮细胞悬液中的NO、ET-1及TNF-α水平与HUA组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；与HUA+U50488H组相比，Nor-BNI、AKT 抑制剂及L-NAME可阻断U50488H，逆转高尿酸对内皮细胞功能的抑制作用及炎症反应。

综上所述，U50488H可激活eNOS/ AKT信号通路，改善HUA大鼠内皮细胞功能。本研究不足之处在于分析通路相关蛋白不够全面，缺乏组织学直观证据，在后续研究中可进一步完善。