小分子抑制剂LGK-974对乳腺癌细胞MCF-7 和MB231生物学特性的影响*

李小琼，姜成利，李宇宸，陈洪清，胡琼英△

1.眉山市人民医院 检验科（眉山 620000）；2.成都中医药大学附属医院 检验科（成都 610072）

乳腺癌是全球范围内女性较常见的恶性肿瘤之一，是超过100多个国家中位列女性癌症死亡的主要原因。据《2018年全球癌症统计》[1]报道，每年约有210万例新诊女性癌症患者（占总病例的24.2%），其中约6万例患者死于乳腺癌。尽管乳腺癌的发病机制尚未完全阐明，但已有研究[2]表明，Wnt信号通路在乳腺癌的发生、进展、免疫微环境调控以及干细胞的干性维持等过程中，均起着十分重要的作用。Wnt信号通路主要包括：Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路经典途径、Wnt平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）途径和Wnt/Ca2+信号通路。其中，Wnt/β-catenin是生物进化过程中高度保守的信号通路，在个体发育和组织稳态中起着重要作用，其异常激活与乳腺癌的发生和转移密切相关[3-4]。近年来，随着Wnt/β-catenin信号通路的不断深入研究，发现Wnt1（第1个被发现的Wnt基因）转基因小鼠的导管明显增生，部分小鼠在6个月大时就可发生乳腺癌，该现象表明Wnt信号通路的激活可促进乳腺癌的发生[5]。此外，也有研究[6]认为，Wnt/β-catenin信号通路也与乳腺癌的侵袭和转移关系密切，通过对乳腺癌患者的分析，结果显示c-Myb通过激活Wnt/β-catenin/Axin2信号通路而成为乳腺癌侵袭和转移的启动子。以上研究表明，Wnt信号通路可能是乳腺癌发病的关键通路。因此，靶向Wnt通路可能是设计和开发治疗乳腺癌的新型方法，以小分子化合物LGK-974为代表的Wnt特异性酰基转移酶Porcupine抑制剂被相继开发出来，可导致配体驱动的途径激活中断，作为潜在的乳腺癌治疗方法，具有相当广阔的应用前景[7]。目前，已明确LGK-974可抑制Wnt/β-catenin信号通路活性和炎症反应[8]，对结肠癌[9]、肾癌[10]均有抑制作用。然而，LGK-974调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌的研究尚处于探索之中。由于Wnt/β-catenin信号通路与乳腺癌的发生、发展和转移密切相关，LGK-974对Wnt/β-catenin信号通路的作用研究已有部分报道，因此探索LGK-974对乳腺癌细胞的生物学特性研究可为LGK-974在乳腺癌中的治疗价值提供证据。本研究旨在探讨LGK-974对乳腺癌细胞系MCF-7和MB231细胞活力、周期分布、迁移和侵袭能力等生物活性的影响及可能的作用机制，以期为探明乳腺癌的发生机制提供新的证据，为乳腺癌的治疗寻找潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳腺癌细胞系MCF-7和MB231（飞鸥尔生物，成都），细胞培养基MEM（Life Technologies，美国），南美胎牛血清（Gibco，美国），CCK-8试剂盒（Sigma-Aldrich，美国），Transwell小室和Matrigel基质胶（Costar，美国），三羟甲基氨基甲烷和十二烷基硫酸钠（Biofroxx，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养培养乳腺癌细胞系MCF-7和MB231细胞，在细胞融合度达到70%～90%时，采用0.25%胰酶/EDTA消化液悬浮细胞，并接种细胞1×104个/孔至96孔板上，加入对应浓度的LGK-974处理24 h，并进行后续分析。

1.2.2 CCK-8分析细胞活力制备乳腺癌细胞系MCF-7和MB231的细胞悬浮液，将细胞调节至1×106个/mL，接种于96孔平板中，贴壁过夜培养。在每孔中加入不同浓度的LGK-974 （0、10、20、30、40、50 μmol/L）。处理1～5 d 后，加入CCK-8 （Sigma-Aldrich）反应液，避光37 ℃、5%CO2培养箱孵育4 h，取出后用酶标仪测定450 nm波长的吸光度D值。

1.2.3 流式细胞术分析检测细胞周期选用不同浓度的LGK-974分别处理乳腺癌细胞系MCF-7（20 μmol/L） 和MB231（25 μmol/L）细胞24 h，用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色细胞并进行流式细胞分析检测细胞周期分布。

1.2.4 蛋白质印迹技术检测细胞周期关键蛋白选用不同浓度的LGK-974分别处理两种细胞24 h，处理收集蛋白，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰 胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分 离20 μg总 蛋 白（细胞周期关键蛋白CD C 2 5 A、C D C 2 5 C，磷酸化CHK2和P21），并将免疫印迹转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以含5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）封闭。将抗体按1∶1 000稀释后，加至PVDF膜，室 温 孵 育1 h。用T-PBS（预 冷）清洗PVDF膜，将1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶联抗兔二抗与PVDF膜室温孵育30 min。T-PBS清洗3次后，用X胶片曝光。

1.2.5 划痕试验检测细胞迁移能力选用不同浓度的LGK-974分别处理乳腺癌细胞系MCF-7（20 μmol/L）和 MB231（25 μmol/L）细胞24 h，并观察细胞划痕的愈合状况。

1.2.6 细胞迁移实验（Transwell）检测细胞侵袭能力选用不同浓度的LGK-974分别处理乳腺癌细胞系MCF-7（20 μmol/L）和MB231（25 μmol/L）细胞24 h，0.1%结晶紫染色观察细胞穿过覆盖了0.8% Matrigel基质胶的Transwell的细胞数量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 LGK-974对乳腺癌细胞活力的影响

CCK-8试剂盒检测不同浓度LGK-974处理乳腺癌细胞MCF-7和MB231后，结果显示10～50 μmol/L 的LGK974对MCF-7和MB231均具有细胞活力抑制作用，最终选定MCF-7细胞的抑制浓度为20 μmol/L的 LGK-974，MB231细胞的抑制浓度为25 μmol/L的LGK-974（图1A～B）。在此浓度作用下，LGK-974降低了MCF-7和MB231细胞在3～5 d的细胞活力，差异有统计学意义（图1C～D）（P＜0.05）。

图1 LGK-974对乳腺癌细胞MCF-7、MB231的生长作用

2.2 LGK-974对乳腺癌细胞周期的影响

20、25 μmol/L的LGK-974分别处理乳腺癌MCF-7和MB231细胞后，应用流式细胞术分析细胞周期结果显示，LGK-974增加了MCF-7和MB231细胞G1/G0比 率，降 低 了MCF-7和MB231细 胞G2/M比率（图2A～B）。蛋白质印迹技术进一步分析细胞周期蛋白表达情况，结果显示，LGK-974处理MCF-7和MB231细胞后，细胞周期蛋白CDC25A和CDC25C的含量明显降低；细胞周期蛋白p-CHK2和P21的含量明显增加（图2C）。

图2 LGK-974对乳腺癌细胞MCF-7、MB231细胞周期的影响

2.3 LGK-974对乳腺癌细胞细胞迁移和侵袭能力的影响

20、25 μmol/L的LGK-974分别处理乳腺癌MCF-7和MB231细胞后，实验组划痕愈合率低于对照组 （图3A～B）。侵袭实验的结果表明：20、25 μmol/L的LGK-974分别处理MCF-7和MB231细胞后，穿透膜层的细胞数目明显减少（图3C～D）。

图3 LGK-974对细胞迁移和侵袭能力的影响

3 讨论

抑制Porcupine可阻止Wnt配体的十六烷酰化，进而阻断Wnt向胞外膜的转运，从而防止β-catenin的过度生成，最终有助于控制细胞的异常生长。截至2021年，Porcupine抑制剂均未上市，仅有LGK974、ETC159、CGX1321和RXC004 4个 分 子 进 入I期 临床试验，是靶向Wnt驱动癌症的较佳选择[11-12]。靶向Wnt通路的癌症具有多样性，有关LGK-974对癌症研究的基础实验已有部分报道。Tammela等[13]在小鼠的体内实验中发现，经过遗传改造的小鼠，Wnt通路抑制剂LGK-974可明显抑制移植细胞的成瘤能力，从而抑制肿瘤生长，并使罹患癌症的小鼠寿命延长近50%。在另一项结直肠癌的研究[14]中，发现结直肠癌细胞系VACO6和SNU1411细胞对LGK-974的阻断作用敏感，用LGK-974长期治疗VACO6细胞可导致一个耐药群体出现，该群体携带Wnt通路抑制剂AXIN1的两个移位缺失，随之导致相关蛋白丢失。LGK-974的I期临床试验[15]也表明，口服LGK-974能诱导有效的Wnt信号抑制，并导致多种类型癌症的生长和进展受到抑制。以上研究均证实LGK-974在多种肿瘤进展中具有抑制作用，但对乳腺癌的相关研究中证据较少。目前确诊为乳腺肿瘤的患者可采用的治疗策略多样，如靶向治疗、激素治疗、放疗、手术和化疗，但一旦出现远处转移，治疗的主要目的是提高生活质量和生存率[16]。因此，靶向药物的选择和研发，除了关注其抑制乳腺癌细胞的增殖活性外，针对乳腺癌侵袭及迁移的抑制能力更是乳腺癌治疗的研究热点。

本研究在检测LGK-974对乳腺癌细胞MCF-7和MB231的生物学活性影响情况时，设计了细胞的增殖、周期分布及细胞周期蛋白的表达、迁移和侵袭能力等实验来证实LGK-974作为乳腺癌治疗的潜在价值。通过筛选不同浓度的LGK-974，分别处理乳腺癌细胞系MCF-7和MB231细胞，结果显示，当LGK-974的处理浓度分别为20 μmol/L和25 μmol/L时，对MCF-7和MB231细胞可以达到最佳的细胞活力抑制效果。此时，MCF-7和MB231细胞的G1/G0比率增加，G2/M比率降低，表明LGK-974对乳腺癌细胞MCF-7和MB231细胞的抑制主要阻滞G2/M期，从而抑制细胞增殖。同时，周期关键蛋白CDC25A、CDC25C的含量减少，p-CHK2、P21的含量则增加。以上结果说明，LGK-974对细胞增殖的抑制作用主要通过抑制细胞周期相关蛋白发生。为了进一步了解LGK-974对乳腺癌细胞侵袭转移的影响，本研究在划痕实验中观察到，经LGK-974处理后的MCF-7和MB231细胞划痕愈合能力减弱；在细胞迁移实验中发现，经LGK-974处理后的MCF-7和MB231细胞穿过Transwell膜孔的数量明显减少，穿孔能力减弱，这也说明LGK-974具有抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的能力。因此，下一步可继续深入研究LGK-974抑制乳腺癌细胞的细胞周期及恶性行为的信号通路，明确其作用机制。

综上所述，本研究通过LGK-974对乳腺癌细胞的增殖活力、细胞周期、转移和侵袭的研究，证实了Wnt通路抑制剂LGK-974对乳腺癌细胞的抑制作用，该结果为后续实验提供了可行性证据，为乳腺癌的治疗提供了新依据， 为LGK-974的应用拓宽了新领域。但本研究仍存在一定局限性，LGK-974抑制乳腺癌细胞生物学特性可能存在其他机制，尚需体内外实验及临床试验来进一步探索。