辣椒中LACS家族基因鉴定及其对非生物胁迫的响应

贾切，刘亚博,*，王飞，姚明华，余楚英，沈胜,3，刘奕清,，李宁

1.长江大学园艺园林学院，长江大学香辛作物研究院，湖北 荆州 434025 2.蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北 武汉 430064 3.海南大学园艺学院，海南 海口 570228

长链脂酰辅酶A合成酶(Long-Chain Acyl-Coenzyme A Synthetase，LACS)是ACS家族中的一类酶，在几乎所有脂肪酸衍生分子的生物代谢途径中都具有重要的作用[1]。LACS将游离脂肪酸酯化成酰基辅酶A，这是大多数脂肪代谢酶利用脂肪酸所必需的关键活化步骤。LACS通过2个步骤催化酰基辅酶A的形成。首先游离脂肪酸通过ATP的焦磷酸分解转化为酰基-AMP中间体，称为腺苷；然后腺苷酸酯的活性羰基碳与辅酶A的硫醇基团偶联，释放AMP和酰基辅酶A最终产物[2]。酶结合腺苷酸的形成机制在生物体中广泛存在，这种机制上的相似性反映在酶的氨基酸基序的保守上，特别是一个基序(ProSite PS00455)非常保守，也是AMP-binding超家族所共有的氨基酸保守基序，此外AMP-binding超家族还有1个保守的ACS信号基序[1,3]。LACS家族成员的蛋白质序列中均具有AMP-binding结构域。

LACS在脂类生物合成中的作用在细菌[4,5]、酵母菌[6]、绿藻[7]、哺乳动物细胞[8]和植物[1,9-11]中被广泛研究。在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中共鉴定出9个LACS基因，分别定位于拟南芥的不同细胞器中，均参与了脂肪酸衍生分子的生物合成途径。AtLACS1～AtLACS3参与脂肪酸的跨膜移动和角质层生物合成[9,12-14]，AtLACS4和AtLACS9在内质网和叶绿体之间的脂质运输中具有很强的重叠功能[15]，AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4、AtLACS8和AtLACS9均与蜡质合成有关，并影响表皮脂质代谢[12,16]；AtLACS1和AtLACS9还参与种子油脂的合成，AtLACS6和AtLACS7参与脂肪酸的β-氧化[17]。AtLACSs的表达具有组织特异性，AtLACS5在花中特异表达[1]，AtLACS1、AtLACS2、AtLACS4和AtLACS9在的种子中表现出较高的表达水平。对大豆、向日葵等作物中LACS家族的研究表明，其在脂肪酸代谢、角质和表皮蜡合成、花粉涂层形成等多个生化过程中起着关键作用[11, 16, 18, 19]。此外，LACS基因在植物逆境胁迫中也具有重要作用，角质和表皮蜡质的积累有助于提高植物对渗透胁迫、病原菌侵染等的耐受性[20-22]。与其他作物相比，在辣椒中LACS家族基因的功能尚不明确。本研究拟利用生物信息学分析方法在辣椒全基因组范围内鉴定CaLACS基因家族，分析其染色体定位、系统进化、基因结构、保守基序等，并分析CaLACS基因在辣椒不同组织和非生物逆境胁迫下的表达模式，以期为后续利用分子生物学手段深入研究CaLACS基因家族在辣椒脂代谢及非生物胁迫中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 辣椒CaLACS基因家族的鉴定

从茄科作物基因组网站SGN(https://solgenomics.net/)下载辣椒‘Zunla-1’参考基因组信息，Ensembl Plants在线数据库下载拟南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)参考基因组信息。在Pfam数据库中下载LACS基因家族保守结构域AMP-binding(PF00501)的种子序列，利用HMMER3.0软件对‘Zunla-1’基因组功能注释的蛋白质序列进行本地化检索。对所得的结果分别在Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行结构域预测，选择具有AMP-binding结构域的成员进行后续分析。

1.2 CaLACS蛋白质理化性质分析、染色体定位

利用ExPASy ProtParam在线程序(https://web.expasy.org/protparam/)对筛选到的基因进行氨基酸数目、分子量和等电点等理化性质预测。通过Cell-PLoc在线程序(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)对CaLACS基因进行亚细胞定位预测。凭借Sequence Manipulation Suite在线程序(http://www.detaibio.com/)对CaLACS蛋白质亲水性进行分析。根据辣椒‘Zunla-1’基因组文件信息，利用TBtools软件[23]对辣椒CaLACS基因家族进行染色体位置分析。

1.3 进化树、基因结构和保守基序分析

利用Cluster omega在线程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，进行蛋白质序列的多重序列比对分析、构建邻接树，研究辣椒与双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻间LACS基因家族的进化关系。根据参考基因组GFF3文件，分析CaLACS的基因结构。利用MEME(http://meme-suite.org/)软件分析辣椒CaLACS基因家族成员保守基序(motif)类型和排列顺序，获得基因家族基序特点。利用GeneDoc(Version 2.7)软件绘制多重序列比对图，TBtools软件[23]绘制相关基因结构和保守基因结构图。

1.4 顺式作用元件分析

提取CaLACS基因起始密码子上游2000bp序列，提交至在线网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测基因启动子区域顺式作用元件，TBtools软件[23]进行可视化分析。

1.5 基因表达模式分析

1.5.1 材料处理

将辣椒耐盐自交系‘H1023’和盐敏感自交系‘XWHJ-M’分别用清水喷施对照与0.25mol/L NaCl处理3h、3d后取样，样品液氮速冻后研磨成粉，于-80℃冻存备用。

1.5.2 荧光定量PCR分析

使用TRIzol试剂(Invitrogen，USA)提取总RNA。使用 HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，南京)进行cDNA合成。使用Primer Premier 3.0在线软件设计 qRT-PCR引物(见表1)，以辣椒CaUBI3为内参基因。使用ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)进行qRT-PCR反应。反应程序：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s和72℃延伸20s，40个循环。重复3次。采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量，使用TBtools软件[23]绘制表达热图。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.5.3 转录组数据分析

辣椒‘6421’不同组织表达谱数据来源于PepperHub在线数据库[24，25]，不同非生物胁迫处理(NaCl、低温、热胁迫)基因表达谱数据来源PepperHub在线数据库。分析不同转录组试验中CaLACS基因家族的表达模式，TBtools软件[23]绘制表达热图。

2 结果与分析

2.1 辣椒LACS基因家族的鉴定、染色体定位与理化特征分析

以‘Zunla-1’为参考基因组从中共鉴定到10个CaLACS基因。在10个CaLACSs中，有7个基因被定位到辣椒辣椒1、3、4、7、8、9号染色体上(见图1)，而CALACS1、CALACS2和CALACS3未被定位在染色体上。10个CaLACSs基因编码区序列的长度在1215～2172bp之间，编码的蛋白氨基酸数量在404～723之间，蛋白分子质量在45.34～79.47ku之间，等电点在6.13～8.81之间，蛋白亲水性在-0.297～0.012之间，亚细胞定位预测大多数蛋白仅存在于过氧化物酶体中，CaLACS2编码的蛋白还存在于叶绿体中(见表2)。

图1 ‘Zunla-1’辣椒LACS基因家族的染色体定位Fig.1 Chromosome mapping of LACS gene family in pepper ‘Zunla-1’

表2 ‘Zunla-1’辣椒LACS基因家族的基本信息Table 2 Basic information of LACS gene family in pepper variety ‘Zunla-1’

2.2 辣椒LACS基因家族的系统进化与基因结构分析

构建辣椒和单子叶植物拟南芥、双子叶植物水稻等28个LACS基因的系统发育树(见图2)，结果表明，3个物种的LACSs基因可划分为8个亚家族：Group Ⅰ包括3个CaLACS基因，分别是CaLACS8、CaLACS10和CaLACS7；Group Ⅱ包括CaLACS6和CaLACS1，Group Ⅲ包括CaLACS4；Group Ⅴ和Group Ⅶ仅包含辣椒LACS基因，分别包含1个和3个CaLACS基因；Group Ⅵ和Group Ⅷ不包括辣椒CaLACS基因，Group Ⅵ只包含拟南芥AtLACS基因，而Group Ⅷ只包括水稻OsLACS基因；除Group Ⅲ中的CaLACS4和LOCOs05g04170位于同一分支外，总体上单、双子叶植物的LACS形成了不同的亚组分支。

图2 ‘Zunla-1’辣椒与拟南芥和水稻的LACS基因家族系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of LACS gene family in pepper ‘Zunla-1’ with Arabidopsis thaliana and rice

对CaLACS、AtLACS和OsLACS的基因结构和结构域分析表明(见图3)，划分在同一亚组的CaLACS、AtLACS和OsLACS的内含子和外显子数目基本一致，区别主要体现在长度上；CaLACS、AtLACS和OsLACS的蛋白序列均具有LACS基因家族的保守结构域AMP-binding结构域(motif 5)、AFD class Ⅰ超家族。Group Ⅰ中LOCOs11g06880由motif 13和motif 3构成PLN02387结构域，其他成员由motif 16和motif 3构成PLN02387结构域；Group Ⅱ中成员均具有motif 17和motif 3构成的PLN02736结构域；Group Ⅲ中成员均具有motif 20和motif 3构成的PLN02430结构域；Group Ⅳ成员具有motif 20和motif 3构成的PLN02861结构域，Group Ⅴ、Group Ⅵ、Group Ⅶ与Group Ⅷ中除CALACS2由motif 8和motif 3构成PLN02614结构域与CALACS3由motif 13和motif 3构成PLN02614结构域外，其他成员均由motif 20和motif 3构成PLN02614结构域，说明CaLACS蛋白在进化上是高度保守的(见图4)。

图3 辣椒LACS家族的基因结构分析Fig.3 Gene structure analysis of LACS family in pepper

图4 辣椒LACS基因家族的保守基序分析Fig.4 Analysis of conserved motifs of the LACS gene family in pepper

2.3 辣椒LACS基因启动子区顺式作用元件分析

对CaLACS基因家族成员的启动子区顺式作用元件进行分析，结果(见图5)显示CaLACS基因启动子区具有G-Box、TATA-box和光响应元件，TC-rich repeats、LTR等响应逆境和防御胁迫等响应元件，以及TATC-box、TGACG-motif和ABRE等响应激素的元件，暗示CaLACS基因家族可能与非生物胁迫相关。

图5 辣椒LACS家族的基因启动子区顺式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements in gene promoter region of pepper LACS family

2.4 辣椒CaLACS基因家族的组织表达分析

利用辣椒材料‘6421’在Pepper Hub网站的组织表达谱数据，分析CaLACS基因家族成员在不同组织和不同发育时期的表达情况。结果(见图6)显示，在幼叶期发育期、开花期和坐果早期CaLACS4的表达量最高；CaLACS1在种子发育后期的表达量较高，CaLACS7和CaLACS8在辣椒果实和胎座中的表达量较高。

注：L1～L9分别代表新叶刚现后2、5、10、15、20、25、30、40、50d；AL、AR、AS分别为成年植株叶、茎、根；F1～F9分别代表花蕾现蕾后2、5、10、15、20、25、30、40、50d；P10、O10、STA10分别代表完全开放花(F10)的花瓣、子房和雄蕊；FST0和FST1分别代表授粉3d、7d后含果肉种子胎座的整果；G1～G11分别代表授粉10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60d的果肉；ST1和ST2分别代表授粉10d和15d后的种子和胎座；S3～S11分别代表授粉20、25、30、35、40、45、50、55、60d的种子；T3～T11分别代表授粉20、25、30、35、40、45、50、55、60d的胎座。图6 ‘6421’辣椒LACS基因家族在不同组织中的表达模式Fig.6 Expression patterns of LACS gene family from pepper ‘6421’ in different tissues

2.5 辣椒CaLACS基因家族在非生物胁迫下表达分析

利用Pepper Hub表达谱数据，对10个CaLACS基因在不同非生物逆境胁迫下叶片和根部组织的表达情况进行分析。结果(见图7)显示，NaCl胁迫下CaLACS1基因在处理12h时的叶片中显著上调表达；CaLACS1和CaLACS2基因在根部均显著受NaCl诱导表达，其中CaLACS2基因在NaCl胁迫3h时的根部中表达量最高。低温胁迫处理下，除CaLACS5、CaLACS6和CaLACS9外均受低温诱导在叶片中表达，其中CaLACS1基因在处理24h时的叶片中表达量最高；CaLACS2基因受低温诱导在根部显著表达，与对照0h相比，在处理1、1.5、3h和6h时的根部中均显著上调表达。高温胁迫下，CaLACS8基因在叶片和根部均受到诱导表达，在处理24h时的表达量最高；CaLACS2基因在高温胁迫1h和3h时的根部中表达量较高。综合CaLACS基因的表达谱数据推测，辣椒中CaLACS1和CaLACS2基因与非生物胁迫响应密切相关。

注：CK_L为叶片对照；CK_R为根对照；NL_1h、NL_1.5h、NL_3h、NL_6h、NL_12h、NL_24h分别代表NaCl胁迫处理1、1.5、3、6、12、24h后的叶片样品；NR_1h、NR_1.5h、NR_3h、NR_6h、NR_12h、NR_24h分别代表NaCl胁迫处理1、1.5、3、6、12、24h后的根部样品；FL_1h、FL_1.5h、FL_3h、FL_6h、FL_12h、FL_24h分别代表低温胁迫处理1、1.5、3、6、12、24h后的叶片样品；FR_1h、FR_1.5h、FR_3h、FR_6h、FR_12h、FR_24h分别代表低温胁迫处理1、1.5、3、6、12、24h后的根部样品；HL_1h、HL_1.5h、HL_3h、HL_6h、HL_12h、HL_24h分别代表热胁迫处理1、1.5、3、6、12、24h后的叶片样品；HR_1h、HR_1.5h、HR_3h、HR_6h、HR_12h、HR_24h分别代表热胁迫处理1、1.5、3、6、12、24h后的根部样品。图7 ‘6421’辣椒LACS基因家族在不同非生物胁迫下的表达模式Fig.7 Expression patterns of LACS gene family from pepper ‘6421’ in different abiotic stress

2.6 不同盐敏感品种中CaLACS基因家族对盐胁迫响应的表达分析

为进一步验证CaLACS基因在盐胁迫处理下的表达情况，利用qPCR方法分析耐盐自交系‘H1023’和盐敏感自交系‘XWHJ-M’在3h和3d盐胁迫处理下CaLACS基因的表达情况。结果(见图8)表明，CaLACS1和CaLACS2基因在叶片中均显著受NaCl诱导表达，耐盐品种比盐敏感品种的表达量更高，也表明CaLACS1和CaLACS2基因在NaCl胁迫中发挥重要的作用。

注：A_CK代表H1023喷施清水对照;A_3h代表H1023盐处理3h;A_3d代表H1023盐处理3d；B_CK代表XWHJ-M喷施清水对照;B_3h代表XWHJ-M盐处理3h;B_3d代表XWHJ-M盐处理3d。图8 辣椒LACS基因家族在不同盐耐受性品种中NaCl胁迫下的表达模式 Fig.8 Expression patterns of LACS gene family in pepperunder NaCl stress in different salt-tolerant cultivars

3 讨论

与拟南芥和水稻等模式作物相比，辣椒中CaLACS家族中基因的相关研究还鲜有报道。本研究共鉴定出10个辣椒CaLACS家族成员，而在拟南芥[1]、甘蓝型油菜[16]、苹果[26]等作物中分别鉴定出9、34、11个LACSs基因，这可能是由于不同物种的基因组大小与基因复制方式不同，从而导致鉴定得到的LACSs成员数量不同。通过进化与基因结构等分析将LACSs 家族基因分为了8个亚家族，同一亚组内的CaLACS与拟南芥和水稻的外显子数量基本一致，保守基序相同或相似，说明LACSs基因在进化上比较保守，同一亚组内的LACSs基因可能具有相似的功能[20-22]。

研究发现CaLACS基因启动子区含有多个与激素响应和逆境胁迫相关的调控元件，表明CaLACS基因家族可能与非生物胁迫胁迫相关[27]。前人研究表明，与CaLACS1同一亚组的拟南芥AT3G05970为种子萌发和其他需要能量的生理过程提供能量[1]，公共数据库的表达谱数据分析显示，CaLACS1和CaLACS2在非生物胁迫下均具有较高的表达量，荧光定量数据也显示，不同盐耐受性品种在NaCl胁迫下，CaLACS1和CaLACS2基因均显著受NaCl诱导表达，以上结果说明这2个基因可能与非生物胁迫响应关系密切。在后续的研究中，可以进一步验证这2个基因在非生物胁迫中的功能。有研究表明，与CaLACS4同一亚组的拟南芥AT2G47240参与蜡的生物合成[12]，还是花粉被膜形成的关键基因[15]。对辣椒组织表达谱数据分析表明，基因CaLACS1和CaLACS4在花芽、果实、种子中均有较高的表达量，推测这2个基因可能与辣椒的生长发育相关，但其在脂类合成代谢中的作用尚不清楚，有待后续深入研究。

本研究利用生物信息学手段和公共数据在详细分析辣椒CaLACS家族基因和初步解析其理化性质、亚细胞定位预测的基础上，进行了辣椒LACSs进化、基因结构、保守基序及表达模式等分析，结合荧光定量PCR分析CaLACS基因家族在不同盐耐受性品种中NaCl胁迫下的表达模式，挖掘盐胁迫响应候选CaLACS基因。相关工作为明确CaLACS基因在非渗透胁迫和生长发育中的角色进行了初步的探索，并为今后进行CaLACS家族的基因克隆、功能验证奠定了一定的基础。