脱毒马铃薯开放式组织培养抑菌剂的筛选

李婷婷，刘希元，滕巍，马燕，李彦军

（吉林省蔬菜花卉科学研究院，长春，130033）

传统组织培养要求环境无菌，对操作人员及环节要求严格，导致成本较高，不利于生产应用与推广。开放式组织培养不使用高压蒸汽灭菌锅与超净工作台，降低了组织培养成本，开放式组织培养通过在培养基中添加抑菌剂来代替高温高压灭菌，能够减少培养基中营养成分的损失，降低操作要求，简化组织培养条件。

低毒高效的消毒剂在日常生活中多作为表面消毒剂使用，在开放式组织培养中也有所应用[1，2]，次氯酸钠的消毒抑菌原理主要是其氧化作用与氯化作用能够使病毒体的酶、核酸、蛋白等物质失活，从而达到杀死病原体的目的[3]；次氯酸钠的氯原子能够与细胞膜蛋白质结合，形成氮氯化合物干扰细胞正常代谢，氯离子能改变细胞渗透压，达到抑菌作用[4，5]。因此，本研究使用次氯酸钠溶液浸泡组培瓶与瓶盖消毒，以简化组织培养操作，降低消毒成本。

已有研究表明，香蕉[6]、百合[7，8]、蓝莓[9]、东北红豆杉[10，11]等植物开放式组织培养取得成功，开放式组织培养中抑菌剂的使用种类有抗生素[12，13]、食品或化学防腐剂[14，15]、植物提取物[16]、化学消毒剂[17]等。在脱毒马铃薯开放式组织培养研究中，抑菌剂的使用还有深入研究的价值。高效抑菌剂益培隆可应用在脱毒马铃薯传统组织培养中，本研究进一步探讨益培隆在脱毒马铃薯开放式组织培养中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料马铃薯夏波蒂脱毒苗（吉林农业大学园艺学院），MS培养基（北京酷莱博科技有限公司）、蔗糖（北京酷莱博科技有限公司）、琼脂（北京酷莱博科技有限公司）、次氯酸钠（生物工程上海有限公司）、抑菌剂益培隆（A：10 mL/瓶，B：356 mg/瓶，金博骏蓝生物技术有限公司）。

1.2 试验设计

试验共设置5个益培隆浓度梯度，分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/L，培养基配方：MS+10 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+益培隆，pH值5.8，使用1%的次氯酸钠液浸泡培养瓶与瓶盖进行消毒，紫外线照射实验室30 min，关闭紫外灯后喷雾75%酒精对实验室进行消毒灭菌。每个梯度接种10瓶，每瓶10个茎段，如图1所示，3次重复，光照强度2 000 lx、光照周期12 h/d、温度22℃，培养28 d后测量生长指标，培养28 d后的脱毒苗如图2。

图1 已接种的脱毒苗

图2 培养28 d后的脱毒苗

1.3 试验方法

①开放式培养基的配制 关闭实验室门窗，提前消毒灭菌，浸泡培养容器消毒沥干水分后备用，MS培养基添加蔗糖、琼脂、抑菌剂益培隆，煮沸1 min后分装于提前准备好的培养瓶中，分装后用紫外线照射15 min，不必进行高温高压灭菌。将益培隆B粉末均匀溶解于A溶液中，用纯净水定容至100 mL。

②开放式接种方法 对实验室消毒灭菌后备用，接种前用75%酒精棉擦拭接种台，接种使用的剪子、镊子用酒精灯灼烧消毒，备用的剪子、镊子浸泡于75%酒精中，不使用超净工作台。将长势一致的脱毒苗剪取带有1个腋芽的茎段接种在培养基上。

1.4 测量指标与方法

培养28 d后统计污染率，污染率（%）=污染瓶数/总接种瓶数×100；统计叶片数，叶片数为除原接种茎段老叶外，从顶叶到基部最后1片新发叶的全部叶片数量。测量植株株高、茎粗、鲜质量、干质量、叶面积、叶片叶绿素含量。用直尺测量植株基部到顶部的长度为株高；取植株顶叶下第3与第4片叶间茎段，用游标卡尺测量茎粗；取待测植株，洗净根部培养基，吸干水分，用分析天平称量植株鲜质量；取待测植株，洗净根部培养基，吸干水分后于105℃烘箱中杀青30 min后，调至80℃烘干至恒重，用千分之一分析天平称量植株干质量；取顶叶下第4片叶，用便携式叶绿素仪测量叶片叶绿素含量（SPAD值）；使用称重法测量叶面积，每株待测植株取3片叶片，打孔后称质量1，计算打孔叶面积1，称取全部叶片重量2，计算植株叶面积2，叶面积2=1×2/1。

数据采用Microsoft Excel与DPS统计软件进行处理与分析，使用 最小显著极差法进行多重比较（＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同浓度益培隆处理对脱毒苗污染率的影响

由表1可知，随着培养基中抑菌剂益培隆浓度的提高，脱毒苗的污染率逐渐降低，不添加抑菌剂益培隆时污染率最高，达到60.00%，抑菌剂益培隆浓度为0.8 mL/L时脱毒苗污染率降至0。

2.2 不同浓度益培隆对脱毒苗生长的影响

由表1可知，各处理间株高、茎粗、叶片数、茎节数、叶面积、叶绿素含量6个生长指标差异均不显著，推测原因是益培隆添加较少，以及益培隆抑菌剂本身毒害作用低，所以对马铃薯夏波蒂脱毒苗的生长指标影响较小，对植株生长无抑制作用。但是在0.8 mL/L浓度梯度下，株高、叶面积均高于其他浓度处理与CK，茎粗高于其他浓度处理，植株生长指标较好。

表1 不同益培隆浓度处理下脱毒苗的污染率及脱毒苗生长的影响

3 讨论与结论

开放式组织培养过程中，培养基添加抑菌剂抑制污染的应用较多，但是不同植物种类适用的抑菌剂种类与浓度不同，抑菌剂浓度过高可能影响植株的正常生长，浓度过低则达不到消毒效果。罗燕羽等[18]研究结果表明，在开放式组培中使用抑菌剂益培隆会影响香蕉组培苗的生长，但是本研究中抑菌剂益培隆不影响马铃薯脱毒苗的生长。在以后的开放组培研究中应根据植物种类的不同，选择不同的抑菌剂。康俊等[19]的研究表明，用84消毒液（次氯酸钠）200倍液浸泡组培容器能够降低开放组培的污染率，本试验采用1%次氯酸钠液浸泡培养瓶与瓶盖配合在培养基中添加抑菌剂益培隆能降低污染率，为马铃薯开放式组织培养中抑菌剂的使用提供了参考与理论依据，为马铃薯开放式组织培养的应用与推广奠定了一定的基础。

本研究结果表明，在次氯酸钠浸泡消毒浓度为1%、抑菌剂益培隆浓度为0.8 mL/L时不发生污染，并且夏波蒂马铃薯脱毒苗生长指标良好。因此在马铃薯开放式组织培养中建议培养基配方选择MS+10 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+0.8 mL/L益培隆。