永春佛手茶对溃疡性结肠炎小鼠的辅助保护功能及主要成分分析

彭佳堃，戴伟东，颜涌泉，武柠子，张信岳，李 钦，董明花，陈 丹，高健健，林 智

（1.中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.永春县农业农村局，福建 泉州 362600；4.浙江省神经精神疾病药物研究重点实验室，浙江 杭州 310013）

永春佛手乌龙茶是以福建省永春县‘佛手’茶树品种（cv. Foshou）的鲜叶为原料，经过晒青、做青（凉青、摇青）、炒青、揉捻、初烘、包揉、复烘、复包揉、足火的加工工艺制成。根据焙火工艺的不同，可分为清香型和浓香型永春佛手，经过5 年以上贮藏后可进一步形成具有陈香风味的陈香型乌龙茶。永春佛手乌龙茶因具有独特的香橼香而受到福建、广东、东南亚等地区人民的喜爱。永春佛手鲜叶烘干样中茶多酚（34.3%）和儿茶素（20.6%）相对含量高于铁观音（茶多酚22.1%、儿茶素12.2%），咖啡碱含量差异不大，此外用永春佛手品种制成的乌龙茶，其黄酮类成分含量高于其他品种乌龙茶，达到10.68～12.81 mg/g。茶叶中的黄酮类化合物主要以糖苷形式存在，具有抗氧化、抗肿瘤和抑菌等活性。乌龙茶具有多种生物活性，如抗过敏、降血糖、减肥降脂、预防心血管疾病等，对于人体具有良好的保健功效。除了上述作用，永春佛手乌龙茶可能还具有保护胃肠道的功能。福建省永春县民间常用永春佛手乌龙茶治疗结肠炎等胃肠道疾病；动物实验研究表明，对乙酸性结肠炎模型大鼠灌胃3 g/kg的永春佛手茶汤，能够明显减少模型大鼠的黏液便和缩短便血持续时间，其粪便形成和局部炎症均得到改善，表明永春佛手茶汤对大鼠乙酸性结肠炎具有较为显著的疗效。

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见炎症性肠病，复发率高且病情易反复，临床表现主要为带血腹泻、里急后重、腹痛、大便急症、体质量下降等。对病理部位观察发现，患者结肠和直肠出现黏膜炎症性溃疡，产生白细胞浸润、氧化和亚硝化应激、促炎细胞因子水平上调等病征。该病的病因复杂，可能与环境感染、遗传因素、免疫失调、肠道微生物等多种因素有关。Nie Jiayan等通过分析公共数据库的相关研究发现软饮料的摄入会增加患UC的风险，而大量饮茶则有可能降低该风险。研究表明，绿茶提取物通过降低炎症部位的氧化应激，对乙酸诱导的UC具有保护作用，其中儿茶素等多酚类物质是起到关键作用的化学成分。茶红素是红茶中主要的多酚类物质之一，40 mg/kg的茶红素预处理10 d可显著改善UC引起的腹泻和结肠结构破坏。乌龙茶中也存在大量的多酚类物质，包括儿茶素、聚酯型儿茶素、黄酮及黄酮苷等成分，目前鲜有系统研究乌龙茶对UC保护作用的报道。三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）诱导的UC在各种组织学特征方面类似于人体炎症性肠病，包括中性粒细胞和巨噬细胞浸润结肠黏膜，以及炎症因子水平的增加。本研究通过探究永春佛手乌龙茶提取物对TNBS诱导的UC模型小鼠的保护作用，结合多种生理指标对3 种香型（清香型、浓香型、陈香型）永春佛手乌龙茶进行比较，以期为永春佛手乌龙茶对胃肠道疾病的保健功效提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

BALB/c雄性小鼠，体质量18～22 g，由上海市实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。小鼠饲养于杭州医学院实验动物中心（SPF级），温度18～24 ℃，相对湿度60%～80%，全价颗粒饲料由杭州医学院实验动物中心提供。

清香型、浓香型和陈香型永春佛手乌龙茶由永春县农业农村局收集，为春季采摘驻芽2～4 叶嫩梢及对夹叶经过传统工艺制作而成，陈香型乌龙茶为永春佛手茶贮藏10 年的样品。上述茶叶与水以1∶20（/）的比例煮沸30 min，过滤后冷冻干燥获得3 种香型乌龙茶提取物，密封后置于干燥处保存备用。

5%（质量分数，下同）TNBS、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素（epicatechin，EC）、茶没食子素、没食子酸、槲皮素3--葡萄糖苷、槲皮素3--半乳糖苷、山柰酚3--半乳糖苷、山柰酚3--芸香糖苷、牡荆素、异牡荆素和杨梅苷标准品 美国Sigma公司；水合氯醛（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯） 上海凌峰化学试剂有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；乙腈（色谱级） 德国Merck公司；甲酸（色谱级）日本东京化成工业株式会社；茶氨酸 北京百灵威科技有限公司；咖啡碱 美国Enzo Life Sciences公司。

1.2 仪器与设备

CYTATION1多功能微孔板酶标仪 美国BioTek公司；BS分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；DKB-600A电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；FD GOLD-SIM冷冻干燥机 美国西盟公司；BH-2光学显微镜 日本Olympus公司；超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱（ultra high performance liquid chromatography-quadrupole orbital trap mass spectrometry，UHPLC-Q-Exactive/MS）仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 干预组茶叶提取物剂量计算

按照成人（平均体质量60 kg）每日平均饮茶量（5 g）计算，饮茶剂量为83.33 mg/（kg·d），参照文献中成人（体质量60 kg）与小鼠（体质量20 g）的千克体质量剂量折算系数为9.01计算，小鼠的饮茶剂量为750.83 mg/（kg·d）。按照上述茶叶提取物制备方法，提取率约为25%（冷冻干燥后获得的茶叶提取物质量占茶叶质量的比例），则使用茶叶提取物时小鼠的实际剂量应为187.71 mg/（kg·d），为方便计算，最终茶叶提取物的剂量设定为200 mg/（kg·d）。

1.3.2 急性UC模型小鼠建立

BALB/c雄性小鼠80 只随机分为对照组、模型组及茶叶提取物干预组（分别为清香组、浓香组、陈香组），每组16 只。适应性喂养7 d后，对照组和模型组灌胃给予生理盐水（20 mL/kg），干预组灌胃相应的茶叶提取物（剂量均为200 mg/（kg·d）、灌胃体积为20 mL/kg），灌胃第7天，禁食不禁水36 h后用10 g/100 mL水合氯醛溶液腹腔注射麻醉（5 mL/kg），除对照组外，均以0.1 mL含2% TNBS的50%（体积分数，下同）乙醇溶液（按照（5% TNBS）∶（无水乙醇）∶（蒸馏水）＝4∶5∶1配制）灌肠诱导建立急性UC模型，对照组小鼠灌胃等体积50%乙醇溶液。记录造模前与造模后小鼠体质量，继续灌胃生理盐水和茶叶提取物7 d，剂量同上。

1.3.3 结肠组织质量测定和组织病理学观察

在造模后第7天，处死所有小鼠，取结肠组织，量取结肠长度并称质量，使用预冷的生理盐水清洗干净结肠，拍取典型结肠炎小鼠及正常组小鼠结肠照片，分装结肠，使用质量分数4%多聚甲醛溶液固定病理切片，用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）进行病理组织染色，光学显微镜观察并拍照。

1.3.4 血清炎症因子质量浓度测定

在造模后第7天，处死所有小鼠，取血清，按照ELISA检测试剂盒说明书测定血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α质量浓度。

1.3.5 乌龙茶提取物中主要生化成分检测

参考课题组前期已建立的方法，采用UHPLC-QExactive-MS检测乌龙茶提取物中的主要生化成分，使用Xcalibur 4.2（ThermoFisher，美国）软件，根据标准品的质荷比和保留时间进行定性，根据峰面积进行定量。

液相色谱条件：色谱柱：HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；二元流动相A相为超纯水（含0.1%（体积分数，下同）甲酸），B相为乙腈（含0.1%甲酸），流速0.4 mL/min，进样量3 μL；洗脱程序为：0～0.5 min，2% B；0.5～10.0 min，2%～15% B；10～18 min，15%～40% B；18～20 min，40%～90% B；20.0～20.9 min，90% B；20.9～21.0 min，90%～2% B；21～25 min，2% B。质谱条件：电喷雾电离源，正离子模式；扫描范围/80～1 200；喷雾电压3.5 kV；鞘气和辅助气流速分别为45、10 L/min；辅助气温度350 ℃；离子传输管温度300 ℃。

使用外标法对主要成分进行定量，没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素分别使用对应的表型儿茶素立体异构体EGCG、ECG、EGC、EC进行定量，槲皮素3--芸香糖苷使用槲皮素3--葡萄糖苷进行定量，山柰酚3--葡萄糖苷使用山柰酚3--半乳糖苷进行定量，8---乙基-2-吡咯烷酮取代的EGCG（8---ethyl-2-pyrrolidone substituted EGCG，8--EGCG-cThea）使用课题组前期合成、分离纯化的8---乙基-2-吡咯烷酮取代的EGCG（8---ethyl-2-pyrrolidone substituted EGCG，8--EGCG-cThea）标样（纯度＞95%）进行定量。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 19.0软件进行数据统计和显著性分析，结果表示为平均值±标准差，生理指标的组间检验方法为Student’s-test，主要生化成分的不同香型间检验方法为单因素方差分析（Duncan多重比较）。使用GraphPad Prism 9软件作图。利用软件R 4.1.0的cor函数进行Pearson相关性分析，采用corrplot和chart.Correlation函数进行可视化作图。

2 结果与分析

2.1 永春佛手茶提取物干预对UC模型小鼠体质量减轻的影响

如图1所示，对照组小鼠体质量在50%乙醇溶液灌肠的情况下只在造模后第1～2天体质量明显下降，与造模前相比具有高度显著差异（＜0.001），之后很快恢复到正常水平，造模后第3～7天的体质量与造模前相比均无显著差异（＞0.05），且实验过程中小鼠精神状态良好，活动和饮食均正常。模型组小鼠从造模后第1天开始出现体质量减轻，造模后第2天体质量降至最低，然后体质量缓慢升高，造模后7 d内体质量与造模前相比均差异高度显著（＜0.001）。临床观察显示，模型组小鼠出现精神萎靡、虚弱消瘦、活动性降低、毛发杂乱等表现并伴有粪便稀稠等症状。TNBS造模后，清香组、浓香组和陈香组的小鼠继续给予相应茶叶提取物干预，2 d后各组小鼠体质量均有不同幅度升高，浓香组和陈香组小鼠第5～7天体质量均与造模前无显著差异（＞0.05），清香组小鼠体质量虽有所增加，但与造模前相比仍有极显著或高度显著差异（＜0.01或＜0.001）。

图1 TNBS造模前与造模后小鼠体质量变化Fig. 1 Changes in body mass in mice before and after TNBS treatment

2.2 永春佛手茶提取物干预对UC模型小鼠单位长度结肠质量的影响

如表1所示，模型组小鼠结肠质量显著高于对照组（＜0.05），结肠长度高度显著大于对照组（＜0.001），其单位长度结肠质量与对照组高度显著差异（＜0.001），单位长度结肠质量较对照组增加了40.6%。给予各茶叶提取物干预后，清香组、浓香组、陈香组小鼠结肠质量与模型组无显著差异（＞0.05），而结肠长度均极显著或高度显著大于模型组（＜0.01或＜0.001），单位结肠质量相比模型组分别降低了20.3%、24.4%和16.1%，其中清香组和浓香组小鼠单位长度结肠质量相对于模型组分别达到显著和极显著差异（＜0.05或＜0.01）。

表1 各组小鼠结肠质量、结肠长度和单位长度结肠质量Table 1 Colonic mass, colonic length and colonic mass per unit length of mice in each group

2.3 小鼠结肠形态及病理组织学观察结果

如图2、3所示，对照组小鼠结肠黏膜表面光滑，无出血及水肿现象，HE染色可见结肠结构清晰、层次明显、杯状细胞丰富、各细胞排列紧密、无炎症细胞浸润；TNBS诱发UC后，模型组小鼠结肠肠壁红肿、长度变短、有出血等现象，HE染色表明模型组小鼠结肠有大量炎症细胞浸润，结肠壁明显增厚；各茶叶提取物干预后，各组小鼠结肠外观均有所改善，其中浓香组小鼠结肠病理状态改善最为明显，基本无炎症细胞浸润，结肠壁未增厚，清香组、陈香组小鼠结肠仍有少量炎症细胞浸润。

图2 小鼠结肠形态观察Fig. 2 Morphological observation of mouse colon

图3 光学显微镜下小鼠结肠病理组织HE染色结果（100×）Fig. 3 Histopathological observation of mouse colon under optical microscope (100 ×)

结合模型组小鼠的临床表现、体质量变化、结肠形态及组织病理学观察结果，表明本研究中采用TNBS构建UC模型小鼠成功。各干预组在造模前均灌胃相应永春佛手茶提取物，小鼠未出现不良症状，表明200 mg/（kg·d）剂量的永春佛手茶提取物对小鼠不会造成负面影响。各茶叶提取物干预组小鼠结肠外观和病理组织结构也均有所改善，说明清香、浓香、陈香型永春佛手乌龙茶提取物均缓解了UC造成的小鼠体质量降低和结肠缩短，其中浓香组小鼠结肠病理状态改善最为明显。有研究表明，UC会影响人体的肠道微生物，UC患者的肠道微生物种群丰富度显著低于健康人群，同时失调的菌群还会影响肠道免疫系统，造成炎症加剧。通过中医药、益生菌和移植健康人的肠道微生物来调节UC患者的肠道菌群，具有显著的疗效。文献报道乌龙茶等六大茶类的提取物均能够通过增加潜在有益菌丰度和抑制潜在有害菌丰度来缓解小鼠的肠道炎症。

2.4 小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-10质量浓度的变化

如图4所示，与对照组相比，模型组IL-6、IL-1β、TNF-α质量浓度均高度显著增加（＜0.001），IL-10质量浓度极显著减少（＜0.01）；给予各茶叶提取物干预后，清香组、浓香组、陈香组小鼠IL-1β、IL-6质量浓度与模型组相比均有所降低，其中浓香组IL-1β、IL-6质量浓度分别降低了28.9%和27.1%，与模型组差异显著（＜0.05），陈香组TNF-α质量浓度高度显著高于模型组（＜0.001），清香组和浓香组TNF-α质量浓度与模型组无显著差异（＞0.05），各干预组的IL-10质量浓度相比模型组均有所增加，清香组、浓香组和陈香组分别增加了122.7%、71.8%和76.2%，且均有统计学差异（＜0.001或＜0.05）。

图4 UC小鼠血清中炎症因子质量浓度变化Fig. 4 Changes of inflammatory factors in serum of UC mice

促炎因子和抗炎因子平衡紊乱导致的免疫异常是UC发病机制之一。促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的大量合成和释放会促进B细胞分泌活跃，导致抗体产生和体液免疫反应亢进，进一步激发补体系统而引发炎症反应。IL-10属于抗炎因子，能够通过下调活化的单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子，从而控制肠道免疫调节和改善肠炎。在永春佛手茶提取物干预后，各干预组小鼠血清中促炎因子IL-1β和IL-6质量浓度均有不同程度的降低，与模型组相比，浓香组IL-1β、IL-6质量浓度显著下降（＜0.05），各干预组的IL-10质量浓度高度显著或显著增加（＜0.001或＜0.05），说明永春佛手茶提取物可能通过抑制UC小鼠体内促炎因子的合成，促进抗炎因子IL-10的释放，从而降低免疫反应程度，促进肠道黏膜修复，改善结肠炎症。

2.5 永春佛手乌龙茶提取物中的主要生化成分

如表2所示，茶氨酸作为茶叶中主要的游离氨基酸，在清香型提取物中含量最高，为14.68 mg/g，在浓香型和陈香型提取物中茶氨酸含量仅为清香型提取物的17.4%和60.0%。在儿茶素类化合物中，EGC是含量最高的组分，在3 种香型提取物中均高于70 mg/g，EGCG含量为51.64～58.29 mg/g。同时在3 种香型提取物中非酯型儿茶素（EGC、GC、EC、儿茶素）的总量高于酯型儿茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）总量。儿茶素类化合物中除了EGCG在陈香型提取物中的含量显著高于另两种香型（＜0.05），其他儿茶素类物质均在清香型提取物中含量最高。没食子酸、茶没食子素、咖啡碱和两种-乙基-2-吡咯烷酮取代的黄烷-3-醇（-ethyl-2-pyrrolidinonesubstituted flavan-3-ols，EPSF）类成分（8--EGCG-cThea和8--EGCG-cThea）在陈香型提取物中含量均显著高于清香型和浓香型提取物（＜0.05）。在黄酮糖苷类化合物中，含量最高的为槲皮素3--半乳糖苷，在3 种香型永春佛手乌龙茶提取物中含量均大于1.6 mg/g。含量较高的3 个黄酮糖苷（槲皮素3--芸香糖苷、槲皮素3--半乳糖苷、山柰酚3--芸香糖苷）在清香型提取物中的含量均显著高于浓香型和陈香型（＜0.05），黄酮糖苷总量在清香型提取物中最高。

表2 不同香型永春佛手乌龙茶提取物生化成分含量Table 2 Contents of biochemical components in water extracts from different aroma types of Yongchun Foshou tea mg/g

2.6 永春佛手乌龙茶提取物中生化成分与UC小鼠生理指标相关性分析结果

将永春佛手乌龙茶提取物中主要生化成分含量与UC小鼠单位长度结肠质量、体质量、炎症因子质量浓度等指标进行Pearson相关性分析，从图5中可以发现各成分与生理指标间存在较强的相关性。8--EGCG-cThea和8--EGCG-cThea两个EPSF类成分均与促炎因子IL-1β呈极显著负相关（＜0.01，分别为-0.87和-0.90），与IL-6呈负相关（＞0.05）。黄酮糖苷中槲皮素3--芸香糖苷和山柰酚3--芸香糖苷均与促炎因子TNF-α呈显著负相关（＜0.05，均为-0.68）。与抗炎因子IL-10呈显著正相关（＜0.05）的化学成分有茶氨酸、7 个儿茶素类化合物（GC、EGC、GCG、ECG、CG、EC、儿茶素）、槲皮素3--半乳糖苷和山柰酚3--半乳糖苷，同时黄酮糖苷总量也与IL-10质量浓度高度显著相关（＜0.001，＝0.95）。

图5 永春佛手乌龙茶生化成分与UC小鼠生理指标相关性Fig. 5 Correlation between biochemical components in Yongchun Foshou oolong tea and physiological indexes

研究表明在小鼠肠道炎症损伤中氧化应激水平会提高，其中丙二醛、一氧化氮等氧化介质含量升高，造成肠黏膜损伤，而茶叶中的多酚类物质具有很强的抗氧化能力，能够降低结肠组织的氧化应激水平，其中儿茶素类、没食子酸等化合物效果显著。乌龙茶中的多酚类成分主要包括儿茶素及其氧化产物、原花青素、聚酯型儿茶素、黄酮及其糖苷、酚酸等，尤其是黄酮类成分在永春佛手乌龙茶中的含量显著高于其他茶树品种制作的乌龙茶，这些物质可能通过增强结肠组织的抗氧化能力，抑制氧化应激反应，达到减轻结肠组织损伤的作用。主要生化成分与炎症因子等生理指标的相关性分析表明，乌龙茶中的多种成分协同发挥对UC具有调节作用。前期研究发现，EPSF类化合物对于脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞具有较强的抗炎活性，可通过抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）p65蛋白的表达和磷酸化，以及抑制p65蛋白的核位移，从而抑制NF-κB信号通路的活化，发挥抗炎作用。本研究中浓香型永春佛手乌龙茶具有相对较高的EPSF类成分含量，可能是其具有较好的UC辅助保护功能的重要原因。

3 结 论

通过对UC模型小鼠的生理指标和细胞炎症因子研究分析发现，3 种香型（清香型、浓香型、陈香型）永春佛手茶提取物均可一定程度改善UC引起的小鼠体质量减轻、结肠缩短、肠壁增厚等现象，并降低小鼠机体炎症水平，对UC均具有较好的辅助保护功能，其中浓香型永春佛手茶提取物改善作用最为显著。永春佛手茶提取物的主要化学成分与血清炎症因子相关性分析表明，EPSF类、黄酮糖苷类、儿茶素类等多酚类化合物可能是永春佛手茶改善UC症状的主要成分。茶叶具有天然、健康、安全的特点，将茶叶提取物应用于UC的辅助治疗具有良好的前景。