高压微射流均质法制备二十二碳六烯酸藻油脂质体及其性质分析

李 畅，薛 璐，芦 晶，逄晓阳，张书文，吕加平,*

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种长链多不饱和脂肪酸。研究表明，DHA具有预防心血管疾病、促进大脑发育、缓解阿尔茨海默病等多种生理功能。相比于DHA鱼油，DHA藻油受到的污染少、鱼腥味弱、资源更加丰富，且研究发现DHA藻油食用更加安全，藻类中的DHA很少引起胃肠道不适。然而，DHA不饱和度高，容易受到光、热、氧等不同因素的影响，极易氧化产生氢过氧化物，失去其功能活性及营养价值，这种不稳定性限制了其应用范围。

脂质体是由脂类两亲性物质如磷脂组成的具有类细胞膜结构的一种闭合类球状囊泡，由一层或多层磷脂包裹而成。最早是在1965年由英国科学家Bangham等发现，而后迅速发展成为一种运载体系。将DHA藻油制备成脂质体不仅对DHA能够起到保护作用，且与微米级载体相比，纳米级载体提供了更大的表面积、更好的扩散渗透性，还具有靶向性、长效性等特点。此外，由于被包封后发挥特定作用所需的药物量要比未包封时少，因此可以屏蔽不良味道，大幅提高被包封物质的生物利用度及感官可接受性。脂质体的制备方法多样，其中，高压微射流均质技术近年来不断发展并得以应用，利用这项技术制备的脂质体具有粒径小、分散性均匀、避免使用有毒有机试剂、可实现商业化生产等优势。目前高压微射流均质技术已实现了对高油酸棕榈油、酶制剂、虾油等营养或功能物质的包埋，提高了这些物质的利用率。

近年来，随着对脂质体包埋脂溶性物质相关研究的不断深入，DHA脂质体相关的研究也逐步展开。Rasti等通过薄膜分散法将-3多不饱和脂肪酸包埋进脂质体，并将其与未包埋的鱼油分别添加进食品，通过考察保留率、过氧化值等指标，证明了脂质体的稳定性与适用性。Han Chenlu等利用薄膜分散-超声法制备得到DHA脂质体，通过体内及体外消化实验，证实了脂质体这一运载形式可提高小肠对DHA的吸收。基于此，本研究采用薄膜分散与高压微射流均质技术结合的方法，以DHA藻油脂质体的平均粒径、包封率为主要评价指标进行DHA藻油脂质体制备的单因素试验及响应面优化试验，并考察DHA藻油脂质体物理稳定性、贮藏稳定性及氧化稳定性，旨在开发一种低粒径、较高载量、稳定性好的脂质体运载体系，以便DHA藻油在药品、食品实际加工生产中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DHA藻油（DHA纯度≥40%） 厦门汇盛生物有限公司；大豆磷脂（磷脂酰胆碱纯度≥45%） 上海麦克林生化科技有限公司；胆固醇、吐温-80 国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA124S-CW电子天平 德国Sartorius公司；MVS-1涡旋混合器 北京金北德工贸有限公司；RE 52-05真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化有限公司；AMH-3高压微射流均质机 安拓思纳米技术（苏州）有限公司；Zetasizer Nano ZS纳米粒度分析仪 英国马尔文仪器公司；U-3010UV紫外-可见分光光度计TEM-7500透射电子显微镜 日本日立公司；DSC 8000差示扫描量热仪 美国PE公司；Turbiscan稳定性分析仪法国Formulaction公司；ZDJ-4A自动电位滴定仪 上海雷磁股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA藻油脂质体的制备

将一定量的大豆磷脂、胆固醇、DHA藻油脂溶性物质加入到适量无水乙醇中，用磁力搅拌器搅拌均匀，在45 ℃、真空条件下旋转蒸发除去无水乙醇形成薄膜，将吐温-80加入到0.01 mol/L、pH 7.2的PBS中搅拌均匀，再将PBS倒入装有薄膜容器中振荡水合得到脂质体，用高压微射流均质机在一定压力下处理若干次得到DHA藻油脂质体。

1.3.2 单因素试验

设置大豆磷脂与胆固醇的质量比为6∶1，大豆磷脂与DHA藻油的质量比为8∶1，吐温-80用量占大豆磷脂质量的15%，PBS（0.01 mol/L，后同）的pH值为7.2，高压微射流均质压力为120 MPa，均质次数为3，考察磷脂质量浓度在5、10、20、30、40 mg/mL条件下对DHA藻油脂质体包封率和平均粒径的影响。

设置大豆磷脂质量浓度为20 mg/mL，大豆磷脂与DHA藻油的质量比为8∶1，吐温-80用量占大豆磷脂质量的15%，PBS的pH值为7.2，高压微射流均质压力为120 MPa，均质次数为3，考察大豆磷脂与胆固醇的质量比在4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1条件下对DHA藻油脂质体包封率和平均粒径的影响。

设置大豆磷脂质量浓度为20 mg/mL，大豆磷脂与胆固醇的质量比为6∶1，吐温-80用量占大豆磷脂质量的15%，PBS的pH值为7.2，高压微射流均质压力为120 MPa，均质次数为3，考察大豆磷脂与DHA藻油的质量比在4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、20∶1条件下对DHA藻油脂质体包封率和平均粒径的影响。

设置大豆磷脂质量浓度为20 mg/mL，大豆磷脂与胆固醇的质量比为6∶1，大豆磷脂与DHA藻油的质量比为8∶1，PBS的pH值为7.2，高压微射流均质压力为120 MPa，均质次数为3，考察吐温-80用量占大豆磷脂质量0%、5%、10%、15%、20%条件下对DHA藻油脂质体包封率和平均粒径的影响。

设置大豆磷脂质量浓度为20 mg/mL，大豆磷脂与胆固醇的质量比为6∶1，大豆磷脂与DHA藻油的质量比为8∶1，吐温-80用量占大豆磷脂质量的15%，PBS的pH值为7.2，高压微射流均质次数为3，考察均质压力在0、80、100、120、140、160 MPa条件下对DHA藻油脂质体包封率和平均粒径的影响。

设置大豆磷脂质量浓度为20 mg/mL，大豆磷脂与胆固醇的质量比为6∶1，大豆磷脂与DHA藻油质量比为8∶1，吐温-80用量占大豆磷脂质量的15%，PBS的pH值为7.2，高压微射流均质压力为120 MPa，考察均质1、2、3、4、5、6 次对DHA藻油脂质体包封率和平均粒径的影响。

1.3.3 响应面优化试验及验证实验

在单因素实验基础上，利用Design Expert软件进行响应面试验的设计与分析。以平均粒径为响应值，采用Box-Behnken Design选定三因素三水平进行试验，试验设计见表1。在得到的DHA藻油脂质体最优制备工艺条件下进行3 次实验验证，并在4 ℃条件下保存样品。

表1 响应面试验因素及水平Table1 Codes and levels of independent variables used in response surface design

1.3.4 DHA藻油脂质体性质表征

1.3.4.1 平均粒径、多分散指数的测定

使用Zetasizer Nano ZS纳米粒度分析仪分别测定平均粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI），用蒸馏水将DHA藻油脂质体稀释至合适的质量浓度，平行测定3 次取平均值。

1.3.4.2 包封率的测定

DHA藻油-正己烷溶液标准曲线的绘制：精确称取1 000.0 mg的DHA藻油溶于正己烷，在100 mL容量瓶中定容得到10.0 mg/mL的标准溶液，配制一系列不同质量浓度的DHA藻油-正己烷溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），以正己烷为空白，在288 nm波长处测定吸光度，以DHA藻油的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

采用有机溶剂萃取法并稍作修改以对DHA藻油脂质体的包封率进行测定。取1 mL脂质体于离心管中，加入4 mL正己烷，涡旋混合2 min后机械振荡10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液在288 nm波长处测定吸光度。根据DHA藻油-正己烷溶液标准曲线计算游离DHA藻油的质量，实验重复3 次取平均值。通过下式计算包封率。

式中：为未被包封进脂质体中的游离DHA藻油的质量/g；为制备脂质体时加入的DHA藻油质量/g。

1.3.4.3 微观形态观察

采用透射电子显微镜对经高压微射流均质处理的脂质体（以下简称MF-L）及未经高压微射流均质处理的脂质体（以下简称C-L）的微观形态进行观察。参照Chaves等的方法并稍作修改，将脂质体稀释适当倍数至半透明状态，用饱和的醋酸铀酰负染色法制备观测样品。

1.3.4.4 差示扫描量热分析

用差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）法对MF-L及C-L相变温度进行测定。参照Wang Qianqian等的方法并稍作修改，以空铝锅作为参照，平均样品质量为（10±5）mg，在密封铝锅中加热，温度范围为20～170 ℃，氮气流速为20 mL/min，加热速率为10 ℃/min。

1.3.5 稳定性分析

1.3.5.1 物理稳定性

利用Turbiscan稳定性分析仪对两种DHA藻油脂质体的物理稳定性进行快速分析。取20 mL样品于样品瓶中，温度设定为25 ℃，每1 h扫描一次，扫描24 h，记录稳定性指数（turbiscan stability index，TSI）。

1.3.5.2 贮藏稳定性

将新鲜制备的两种DHA藻油脂质体分别贮藏在4、25 ℃条件下，于第0、28天分别对平均粒径、包封率进行测定。

1.3.5.3 氧化稳定性

将新鲜制备的两种DHA藻油脂质体分别贮藏在4、25 ℃条件下，于第0、7、14、21、28天采用GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》中的电位滴定法对过氧化值进行测定。

1.4 数据处理与分析

实验数据用平均值±标准差表示，并通过SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，以＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1A可知，随着大豆磷脂质量浓度的增大，平均粒径逐渐增大，包封率先升高后降低。低磷脂质量浓度下虽然粒径更小，但包封效果不理想。高磷脂质量浓度虽然可以提高包封率，但过高的磷脂质量浓度容易使体系不稳定，产生絮沉，导致粒径和PDI受到影响。综合考虑，选择20 mg/mL的大豆磷脂质量浓度进行后续实验。

如图1B所示，随着大豆磷脂与藻油质量比的增加，平均粒径总体呈增大趋势，对包封率总体无明显影响。当磷脂与藻油质量比为20∶1时，脂质体的双层膜受到破坏，包封率减小至（80.6±11.5）%，原因可能与制备过程有关，当磷脂含量较多时，在旋蒸过程中很难形成均一稳定的薄膜，导致水合时磷脂析出。考虑到载药量，磷脂与藻油的质量比选择4∶1。

胆固醇是许多生物膜的主成分，对于脂质体的作用主要是通过自身的亲水、亲油基团增加双层膜的刚性、厚度以及结构的有序性。如图1C所示，随着磷脂与胆固醇质量比的增加，平均粒径逐渐减小，包封率逐渐增加。当磷脂与胆固醇质量比为8∶1时，平均粒径最小，包封率达到最高。

吐温-80的加入可提高脂质体的包封率。吐温-80通过物理吸附在脂质体双层膜表面，形成一定厚度的亲水相，使脂质体在体系中更加均匀、稳定，并且在制备过程中有利于脂质体的水化。如图1D所示，当不添加吐温-80时，包封率最低，平均粒径最大。随着吐温-80用量的增加，平均粒径逐渐减小，包封率明显增加。但加入过多的表面活性剂可能溶解脂质体囊泡，对脂质体具有破坏作用，故选择吐温-80用量20%进行后续实验。

如图1E所示，在高压微射流均质技术处理粗脂质体的过程中，随着均质压力的增大，脂质体平均粒径逐渐减小，相比未经该技术处理的脂质体，其包封率明显增加。但在140 MPa均质压力下，脂质体的微囊发生破裂，藻油发生泄漏，包封率降低，这与邰克东等的结论相似。当高压微射流均质压力为120 MPa时，脂质体的平均粒径为（74.93±0.61）nm，包封率为（94.2±0.8）%，较为理想，故选择高压微射流均质压力120 MPa进行后续实验。

图1F中，随着均质次数的增加，脂质体的平均粒径逐渐减小，包封率逐渐增大，均质处理5～6 次对于平均粒径无明显影响。但脂质体囊泡易因均质次数的增加或时间的延长而导致温度升高，体系内容易出现重新聚集现象，故选择均质处理次数5 次。

图1 大豆磷脂质量浓度（A）、磷脂与DHA藻油质量比（B）、磷脂与胆固醇质量比（C）、吐温-80用量（D）、高压微射流均质压力（E）、高压微射流均质次数（F）对DHA藻油脂质体平均粒径、包封率的影响Fig. 1 Effects of soy lecithin concentration (A), lecithin to DHA-rich algae oil mass ratio (B), lecithin to cholesterol mass ratio (C), Tween-80 dosage (D), homogenization pressure (E), and number of homogenization cycles (F) on mean particle size and encapsulation efficiency of DHA-rich algae oil liposomes

2.2 响应面优化试验及验证实验结果

在单因素试验的基础上，以平均粒径为响应值，选择磷脂与胆固醇质量比、吐温-80用量、高压微射流均质压力作三因素三水平响应面优化试验，实验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Box-Behnken design with response variable

对上述试验结果进行回归拟合分析，得到以平均粒径（）为因变量，磷脂与胆固醇质量比（）、吐温-80用量（）、高压微射流均质压力（）为自变量的二次多项回归方程：＝91.39+14.40-5.92-7.40-0.787 5+5.90+3.39-1.45-11.64-9.18。

方差分析结果见表3，模型＝0.001 3＜0.01，表明模型极显著。失拟项＝0.217 0＞0.05，差异不显著，同时模型决定系数＝0.978 0，说明该模型与实际情况拟合程度很好，可用于制备DHA藻油脂质体工艺优化的分析及预测。从分析结果中可知，、、对响应值影响极显著，与影响极显著，的交互作用影响显著，交互作用响应面3D图见图2。其他因素及其相互作用对响应值的影响不显著。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

图2 磷脂与胆固醇质量比、均质压力交互作用对DHA藻油脂质体平均粒径的影响Fig. 2 Response surface plot showing interactive effect of soy lecithin to cholesterol mass ratio and homogenization pressure on mean particle size of DHA-rich algae oil liposomes

根据上述方程可计算最佳制备工艺：磷脂与胆固醇质量比11.9∶1、吐温-80用量15%、高压微射流均质压力138 MPa，平均粒径理论预测值为55.50 nm，使用优化后的工艺制备DHA藻油脂质体并进行验证实验，得到平均粒径为（59.35±3.05）nm，PDI为0.189±0.025，包封率为（94.2±2.9）%。由此可见，利用Box-Behnken试验设计建立的响应曲面模型优化可行。与黄茜等通过薄膜分散单一方法制备得到的DHA藻油脂质体以及涂宗财等通过乙醇注入法结合动态高压微射流法制备得到的鱼油脂质体相比，本研究中制备所得DHA藻油脂质体的平均粒径、包封率更为理想，说明薄膜分散结合高压微射流均质法的使用有效提高了脂质体的性能。

2.3 DHA藻油脂质体的表征

2.3.1 微观结构

通过透射电子显微镜观察到的MF-L与C-L大小、形态等信息如图3所示，MF-L几乎呈球体，分布均匀，与平均粒径测定的结果一致。相比之下，C-L囊泡更大，部分粒径接近1 μm，且均匀性较差。

图3 MF-L放大倍数为60 000×（A）、200 000×（B）和C-L放大倍数为20 000×（C）、12 000×（D）的透射电子显微镜图Fig. 3 TEM images of MF-L at 60 000 × (A), 200 000 × (B) and C-L at 20 000 × (C), 12 000 × (D) magnifications

2.3.2 DSC分析结果

通过DSC分析仪对两种脂质体进行相变温度的分析。图4中与C-L相比，MF-L提高了相变温度，峰值温度由95.49 ℃提高到111.67 ℃，并且具有更小的相变焓，因此磷脂双层膜更加稳定。Wang Qianqian等制备的鱼油粗脂质体通过DSC分析仪测得相变温度为56.17 ℃，低于本研究中制备的DHA藻油脂质体相变温度。不同脂质体制备相关研究中相变温度的差异可能是由于制备时使用的磷脂种类不同。磷脂中脂肪酸链的长度、饱和度直接决定了其相变温度，一般脂肪酸链越长，相变温度越高。

图4 MF-L和C-L的DSC分析曲线Fig. 4 DSC thermograms of MF-L and C-L

2.4 稳定性分析结果

2.4.1 物理稳定性

通过Turbiscan快速稳定性分析仪分析了两种不同处理方式脂质体的物理稳定性，图5为动力学不稳定性曲线。TSI越大，表明体系越不稳定，相比之下C-L更容易发生聚沉，物理稳定性较低。前12 h内，MF-L表现出了良好的稳定性，TSI变化缓慢。12 h以后，虽然MF-L的变化幅度逐渐增大，但仍比C-L的TSI小。说明脂质体粒径的降低对物理稳定性的提高有促进作用。本研究结果与邰克东等研究不同均质压力对脂质体囊泡特性和物理稳定性影响的结论相似。

图5 MF-L和C-L的动力学不稳定性曲线Fig. 5 Kinetic instability curves of MF-L and C-L

2.4.2 贮藏稳定性

如图6～8所示，在贮藏期28 d内，4、25 ℃条件下MF-L和C-L表现出了不同的稳定特性，C-L在4 ℃下贮藏28 d后，平均粒径由739.4 nm增大到942.7 nm（图6），粒径分布由双重峰转变成不规则的多重峰（图7B、E），且藻油泄漏严重（图8），油腥味加剧。两种温度下的C-L包封率呈现迅速下降的趋势，出现絮沉，逐渐失去纳米特性，在25 ℃下贮藏的脂质体絮沉程度比4 ℃下更加剧烈。MF-L在4 ℃条件下贮藏28 d后，平均粒径与包封率无明显变化（图6、8），其在两种温度条件下的粒径分布图峰形平滑，几乎呈单峰分布（图7C、D），且从外观观察，4 ℃条件下比25 ℃变化差异更小，呈半透明状态分布均匀，无絮沉现象。以上实验结果说明MF-L比C-L贮藏稳定性更好，低温条件下贮藏脂质体更能维持其良好特性。

图6 MF-L和C-L在不同贮藏温度与时间下的平均粒径变化Fig. 6 Variation in mean particle size of MF-L and C-L at different storage temperatures and times

图7 第28天MF-L和C-L在不同贮藏温度下的粒径分布Fig. 7 Particle size distribution of MF-L and C-L after 28 days of storage at different temperatures

图8 MF-L和C-L在不同贮藏温度与时间下的包封率变化Fig. 8 Variation in encapsulation efficiency of MF-L and C-L as a function of storage time at different temperatures

2.4.3 氧化稳定性

通过过氧化值的测定评价DHA藻油脂质体的氧化稳定性。由图9可知，随着贮藏时间的延长，4 ℃条件下MF-L和C-L的过氧化值都缓慢增长，且MF-L的过氧化值涨幅低于C-L。7～14 d，25 ℃下C-L过氧化值降低了0.031 mmol/kg，原因是脂质氧化是一个连锁反应过程，脂质体在初级氧化产物的基础上会进一步生成次级氧化产物。从第21天开始，过氧化值呈现明显的上升趋势，25 ℃比4 ℃条件下过氧化值增长速率更快，且C-L的涨幅更大。C-L在贮藏期间大量泄漏油脂，酸败程度加剧。第28天时，25 ℃下C-L具有最高的过氧化值，为（1.840±0.332）mmol/kg。与之相比，MF-L抗氧化能力更强，且4 ℃贮藏效果最好，第28天时过氧化值为（0.353±0.106） mmol/kg。这可能是高压微射流的作用使脂质体结构更加稳定，一方面减少了油脂泄漏量，限制了过氧化物的产生；另一方面磷脂双层对藻油起到了很好的保护作用，防止其被氧化。同时，温度是贮藏过程中的关键影响因素，在低温条件下贮藏脂质体有益于产品功能的保持。

图9 MF-L和C-L在不同贮藏温度与时间下的过氧化值Fig. 9 Peroxide values of MF-L and C-L as a function of storage time at different temperatures

3 结 论

本实验以平均粒径、包封率为主要指标，采用响应面法优化了DHA藻油脂质体的高压微射流均质制备工艺。得到制备的最佳工艺条件为：磷脂质量浓度20 mg/mL、磷脂与藻油的质量比4∶1、磷脂与胆固醇质量比11.9∶1、吐温-80用量15%、均质压力138 MPa、均质次数5 次。在此条件下进行制备，DHA藻油脂质体平均粒径为（59.35±3.05）nm，PDI为0.189±0.025，包封率（94.2±2.9）%。透射电子显微镜观察结果表明，高压微射流均质DHA藻油脂质体微观结构为球状，分布均匀。通过与未经高压微射流技术处理的脂质体对比，高压微射流均质制备的DHA藻油脂质体相变温度有所提高，并在保持稳定性上有一定的优势：28 d的贮藏期内，经处理的DHA藻油脂质体的贮藏稳定性、氧化稳定性良好，且在低温条件下贮藏效果较为理想。本实验所用方法为实际加工中DHA藻油脂质体的应用提供了一定的技术支持，具有广阔的应用前景。