我国部分地区绒山羊乏质体感染情况调查

胡群山，王坤轮，史 柯，宁晓冬，菅复春，索 勋

(1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；3.河南应用技术职业学院，河南 郑州 450042)

绒山羊是我国的一种独特的生物资源，其所产的山羊绒具有颜色洁白如玉、细而柔软等特点，因此被美誉为“纤维宝石” 和“软黄金”，具有重要的经济价值；我国羊绒总产量为18 000吨，约占世界羊绒总产量的75%，是世界上的产绒大国，对发展我国经济、增加农民收入做出了巨大贡献。

乏质体病(又称无浆体病)是一种对人和动物造成严重危害的具有公共卫生学意义的细胞内专性寄生性蜱传血液传染病[1-2]。目前公认的边缘乏质体(A.marginale)、中央乏质体(A.centrale)、嗜吞噬细胞乏质体(A.phagocytophilum)、绵羊乏质体(A.ovis)、牛乏质体(A.bovis)、扁平乏质体(A.platys)及近年发现的山羊乏质体(A.capra)可以对人和各种动物(牛、羊、犬、鼠等)及特定细胞(单核细胞、中性粒细胞、红细胞等)产生危害[3-4]；其中嗜吞噬细胞乏质体于1994年在美国被确定可以造成人粒细胞乏质体病(Human granulocytic ehrlichia，HGE)[5]；绵羊乏质体的变种在2007年首次被确定也可引起人的粒细胞乏质体病[6]。该病目前被广泛报道，已成为在世界范围内广泛流行的一种在经济上较为重要的动物性疾病，并被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)列为绵羊、牛等动物检疫的主要疫病之一[7-8]。我国自20世纪80年代在绒山羊中检测到乏质体以来，目前在内蒙古、河南、山西、辽宁、云南、山东、西藏、新疆等地区山羊及绵羊中均检测到某些种的乏质体，严重制约我国养殖业的发展[9-10]。

为了解我国西北地区绒山羊乏质体病的流行及分布情况，并为该病的综合防控提供依据，本试验用巢氏PCR方法对甘肃、河北、内蒙古、山西、陕西及新疆共6个地区的乏质体感染情况进行了调查。

1 材料与方法

1.1 样品来源 387份绒山羊血液样品，于2016年5～11月采自甘肃、河北、内蒙古、山西、陕西及新疆共6个地区的绒山羊养殖场。逐只经颈静脉采血，每只绒山羊血液样品 2 mL 置EDTA-K2抗凝管内，装入冰盒内带回实验室，置4 ℃冰箱内保存待检。

1.2 主要仪器及试剂 血液基因组DNA提取试剂盒(OMEGA,Norcross,GA,美国)；PCR仪(ABI，美国)；凝胶成像分析系统(SYNGENE，英国)；DYY-5型稳压稳流电泳仪及JY系列电泳槽(北京市六一仪器厂)；ddH2O、rTaqDNA Polymerase、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、LATaqDNA Polymerase、10×LA PCR Buffer、6×DNA Loading Buffer；DL-2 000 DNA marker等(TaKaRa，日本)。

1.3 DNA提取 按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。

1.4 PCR扩增 基于A.phagocytophilum的16S rRNA 基因，A.bovis的16S rRNA基因，A.ovis的msp4基因对所采集的血液样品进行PCR扩增，引物名称、序列及反应条件见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每次PCR扩增均设阳性、阴性对照，PCR产物均在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。

表1 乏质体PCR所用引物及扩增条件Table 1 Primers and amplification conditions used for Anaplasma PCR

1.5 数据分析 利用SPSS 22.0软件对不同地区、不同饲养模式、不同年龄及不同性别绒山羊的乏质体阳性率差异情况进行卡方检验(χ2test)，P<0.05表示差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR检测结果 利用引物SSAP2f/SSAP2r、AB1f/AB1r、MSP4f/MSP4r对采集的387份绒山羊血液DNA样品进行PCR扩增，结果检测出A.phagocytophilum、A.bovis、A.ovis三种乏质体，片段长度大小与预期一致(641 bp、551 bp、584 bp)(见图1、2、3)。

图1 A.phagocytophilum 16S rRNA基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of A.phagocytophilum 16S rRNA geneM：DNA标准DL2000；1～19：PCR产物；20：阳性对照；21：阴性对照M:DNA marker DL2000;1～19：PCR product;20：Positive control;21:Negative control

2.2 不同地区绒山羊血液乏质体感染情况 调查结果(见表2)显示，绒山羊血液乏质体总阳性率为82.4%(319/387)，其中甘肃、河北、内蒙古、山西共4个地区乏质体阳性率均高达100%，陕西和新疆乏质体阳性率稍低，分别为70.6%和63.8%，表明不同地区绒山羊血液乏质体总阳性率统计学差异性显著(χ2=48.747，P<0.05)。A.phagocytophilum、A.bovis和、A.ovis的阳性率分别为24.0%、34.1%和76.5%，不同种乏质体阳性率存在显著差异(χ2=212.972，P<0.05)。

图2 图2 A.bovis 16S rRNA基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of A.bovis 16S rRNA geneM：DNA标准DL2000;1～19：PCR产物;20：阳性对照;21:阴性对照.M:DNA marker DL2000;1～19:PCR product;20:Positive control;21:Negative control

图3 A.ovis msp4基因PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of A.ovis msp4 geneM:DNA标准DL2000；1～9:PCR产物；10:阳性对照；11:阴性对照；13～23:PCR产物M:DNA marker DL2000;1～9:PCR product;10:Positive control;11:Negative control;13～23:PCR product

表2 不同地区绒山羊血液中乏质体感染情况Table 2 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats from different regions (%)

2.3 不同饲养方式绒山羊血液乏质体感染情况 结果(见表3)显示，舍饲、放牧及舍饲+放牧3种饲养方式下乏质体的阳性率分别为77.9%、9.2%和98.6%；舍饲+放牧方式饲养的绒山羊，其3种乏质体的阳性率均显著高于舍饲和放牧的绒山羊。不同饲养方式下乏质体阳性率统计学差异性显著(χ2=16.095，P<0.05)。

表3 不同饲养方式绒山羊血液乏质体感染情况Table 3 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different feeding styles (%)

2.4 不同年龄绒山羊血液乏质体感染情况 大于12月龄的羊乏质体阳性率高达93.9%，3～6月龄的绒山羊乏质体阳性率最低为65.7%，不同年龄下羊群乏质体阳性率统计学差异显著(χ2=26.88，P<0.05)。不同年龄绒山羊血液乏质体感染情况见表4。

表4 不同年龄绒山羊血液乏质体感染情况Table 4 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different ages (%)

2.5 不同性别绒山羊血液乏质体感染情况 雌性绒山羊及雄性绒山羊乏质体的阳性率分别为85.1%、78.1%，差异不显著(χ2=3.058，P>0.05)。不同性别绒山羊血液乏质体感染情况见表5。

表5 不同性别绒山羊血液乏质体感染情况Table 5 The infection rates of Anaplasma in the blood of cashmere goats in different genders (%)

2.6 绒山羊血液中乏质体混合感染情况 387份绒山羊血液样品中同时检出2种及其以上乏质体者占25.3%(98/387)，不同种乏质体混合感染情况见表6。

表6 乏质体混合感染情况Table 6 The mixed infection of Anaplasmas

3 讨论

3.1 乏质体感染在不同省区普遍存在且存在差异 孙明等[15]使用PCR方法检测甘肃省景泰县羊的乏质体感染率为30.6%。Liu等[16]调查发现，山羊的乏质体在不同地区流行情况存在差异，河南省感染率最高(39.1%)，贵州较低(22.0%)。Zhou等[17]对重庆的调查发现，山羊的乏质体的感染率为34.94%。本试验对387份绒山羊血液样品检测发现，乏质体总阳性率为82.4%(319/387)，高于我国其他多数地区及先前的报道，可能与所调查的绒山羊地处牧区或山区，生态环境和地形地貌复杂、植被丰富，利于硬蜱的孳生与繁衍，绒山羊易受到硬蜱的侵袭、叮咬而致乏质体感染率较高，也可能与样品采集时间正值硬蜱活跃季节有关。

3.2 放牧及舍饲+放牧绒山羊乏质体感染率较高 目前，关于放牧羊群乏质体病的报道较多，而舍饲及舍饲+放牧的较少。张菲菲[18]调查发现，放牧模式下的羊乏质体感染率(59.92%)明显高于舍饲模式羊(36.75%)。张文静等[19]调查发现，放牧奶山羊乏质体感染率(48.20%)显著高于舍饲奶山羊(1.24%)。本调查发现，放牧及舍饲+放牧绒山羊乏质体感染率(分别为79.2%、98.6%)高于舍饲绒山羊(77.9%)，与前人调查结果一致，可能与乏质体作为蜱传病原，放牧及舍饲+放牧的饲养方式增加了硬蜱接触、叮咬羊而传播乏质体所致，因此在养羊生产中应加强硬蜱的防控，但舍饲+放牧绒山羊乏质体感染率显著高于放牧和舍饲绒山羊，是否与放牧与舍饲饲养方式转换降低绒山羊抗病力或与检测样品量较小有关，有待进一步探讨。

3.3 不同年龄绒山羊乏质体感染率存在显著差异 吕亚莉[20]调查发现，<1岁的幼龄羊乏质体感染率(34.70%)低于>1岁的大龄羊(43.41%)。Zhou等[17]调查发现，<1岁的山羊乏质体感染率(29.34%)低于>1岁的羊(37.96%)。本次调查结果也显示，不同年龄段羊群乏质体阳性率差异性显著(χ2=26.88，P<0.05)，>1岁的羊群乏质体感染率最高，为93.9%，显著高于其他年龄段的羊。可能由于随着羊的年龄增加，羊一次或多次被硬蜱叮咬而感染，但未得到及时有效治疗而长期携带乏质体所致。

3.4 不同性别绒山羊乏质体感染率差异不显著 Zhou等[17]调查表明，雄性山羊乏质体感染率(37.23%)与雌性山羊(34.03%)不存在显著差异。本次调查结果显示，虽然雌性绒山羊乏质体感染率(85.1%)高于雄性绒山羊(75.1%)，但差异不显著。

本调查结果表明，绒山羊乏质体感染在甘肃、河北、内蒙古、山西、陕西和新疆6省区广泛存在且流行情况较为严重，如甘肃、河北、内蒙古、山西4个地区乏质体阳性率均高达100%，尤其嗜吞噬细胞乏质体作为一种人兽共患病病原，对公共卫生安全和人类健康构成潜在威胁，因此，应高度重视绒山羊乏质体病的防控和灭蜱工作，以保障人和动物健康及养羊业的健康快速发展。