不同日龄鸡肺脏中淋巴细胞的动态分布

张英楠，徐 晶，栾维民，杨树宝1,

(1.吉林医药学院，吉林 吉林 132013;2.长春科技学院生命科学学院，吉林 长春 130600；3.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118)

目前，家禽的呼吸道疾病如禽流感和新城疫等给家禽养殖业带来了巨大的经济损失[1-2]，而肺脏又是家禽许多病毒性和细菌性疾病的主要靶器官，病原体会通过肺呼吸系统黏膜表面进入宿主，然后进一步散布到其他器官中[3]。因此，动物的健康在很大程度上取决于是否能够成功控制病原在肺脏组织尤其是肺脏支气管黏膜表面的入侵和复制。要研究这些疾病的发病机制并采取有效的防治措施，必需要对肺脏相关免疫系统的组织结构和功能有清楚的认识，但是目前还缺乏此方面的研究。

Bienenstock J等(1973年)首次发现鸡肺脏中初级支气管中的淋巴小结与肠道集合淋巴结以及肠相关淋巴样组织有很大的相似性，因此，这些结构被指定为是支气管相关淋巴组织(BALT)[4]。与其他动物相比，家禽体内的BALT分布更为广泛。

孵化期间由蛋壳气孔过滤后的气体是禽类的氧气供应源。出壳之后，雏禽开始接触外界空气，并逐渐适应外界环境，同时其呼吸道结构和功能也得到发育和建立[5]。出壳初期为了适应外界环境，鸡的肺脏也经历着相应的快速变化。伴随着肺脏结构和功能的一系列转变，BALT也应发生着相应的变化。因此，本试验采用免疫组织化学方法研究从鸡胚到出壳后的不同生长发育阶段，肺脏中T、B淋巴细胞的发育情况以及定位分布变化，从而反映发育时期鸡肺脏的免疫状态变化，为进一步研究家禽肺脏的免疫机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 200枚海兰白鸡种蛋，购自长春净月潭旅游开发区银河养殖场，种蛋进行常规孵化，雏鸡进行常规饲养。

1.2 主要试剂及器材 冰冻切片用OCT组织包埋液：美国Sakura公司产品；小鼠抗鸡CD3和Bu-1单克隆抗体：美国Southern Biotechnology公司产品；Ultra Sensitive SP超敏试剂盒kit 9901：福州迈新公司产品。依爱EIF/C.DME3456 孵化机/出雏机：广东依爱孵化机厂生产；Leica CM1850 冰冻切片机：德国Leica公司生产；Olympus CX41 显微镜：日本Olympus公司生产；Pixera pro150ES图像采集器：美国Pixera公司生产。

1.3 试验设计 200只试验用海兰白鸡种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别选择未经疫苗免疫的18、20日龄鸡胚，1、4、7、14、21、35、56日龄和90日龄的雏鸡，每个时期取3只鸡胚或雏鸡的肺脏组织。将肺脏组织制成冰冻切片，片厚5 μm，-80 ℃保存备用。

1.4 免疫组织化学染色程序 每张切片滴加30 mL/L 过氧化氢，室温下孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每张切片分别滴加小鼠抗鸡CD3和Bu-1单克隆抗体工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每张切片滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每张切片加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB显色；苏木精复染；自来水冲洗返蓝；梯度酒精脱水；二甲苯透明；中性树脂封片；照相。

1.5 图像分析及统计学处理 应用Image-pro plus 6.0图像分析软件测定肺脏中单位视野内阳性细胞面积。同一日龄选取3个样本，每个样本制作3张连续切片，每张切片于10倍物镜下随机选取3个视野，取平均值。应用SPSS18.0软件对不同日龄的同一阳性细胞进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 胚胎期及出壳后初期T、B淋巴细胞的分布规律 胚胎18日龄时，CD3+T淋巴细胞出现在肺脏实质中(中插彩版图1A)。胚胎20日龄时，CD3+T淋巴细胞的数量和分布与胚胎18日龄比较无明显变化。1日龄时，CD3+T淋巴细胞继续增多，但着色较弱(中插彩版图1B)。另外，Bu-1+B细胞也首次出现，主要分布于大血管周围(中插彩版图1C)。

图1 胚胎期和出壳后初期肺脏中T、B淋巴细胞的动态变化 (250×)Fig.1 Development of T and B lymphocytes in lung at embryonic stage and early post-hatch period (250×)A：胚胎18日龄，箭头：肺脏实质中的CD3+T细胞；B：1日龄，箭头：小叶间结缔组织中的CD3+T细胞；C：1日龄，箭头：Bu-1+B细胞出现在大血管周围；D：4日龄，箭头：BALT中的CD3+T细胞；E：4日龄，箭头：BALT中的Bu-1+B细胞；F：7日龄，箭头：BALT中的CD3+T细胞；G：7日龄，箭头：BALT中的Bu-1+B细胞；H：7日龄，箭头：分布于气体交换区的实质中淋巴细胞； I：14日龄，箭头：Bu-1+B细胞位于BALT的外周A：18-day-old embryonic chicken,arrow:CD3+T cells in lung parenchyma；B:1-day-old,arrow:CD3+T cells in interlobular connective tissue;C:1-day-old,arrow:Bu-1+ B cells appear around large blood vessels;D:4-day-old,arrow:CD3+T cells in BALT；E:4-day-old,arrow:Bu-1+ B cells in BALT;F:7-day-old,arrow:CD3+T cells in BALT;G:7-day-old,arrow:Bu-1+ B cells in BALT;H:7-day-old,arrow:lymphocytes distributed in the parenchyma of gas exchange region;I:14-day-old,arrow:Bu-1+B cells in the periphery of BALT

4日龄时，在初级支气管与次级支气管交汇处有淋巴细胞的聚集物，即形成了明显的支气管相关性淋巴组织(BALT)。从此时起，肺脏内的淋巴细胞就以两种形式存在，一是集合性淋巴组织—BALT，另外一种是散布在肺小叶中的弥散性淋巴组织。在BALT中CD3+T淋巴细胞的数量明显多于Bu-1+B淋巴细胞(中插彩版图1D、1E)。

7日龄时，BALT更为发达，T、B淋巴细胞都明显增加，CD3+T淋巴细胞仍明显多于Bu-1+B淋巴细胞(图2)，而且CD3+T淋巴细胞占据了BALT的中央区域(中插彩版图1F)，而Bu-1+B淋巴细胞主要环绕在外周(中插彩版图1G)。在肺小叶中，T淋巴细胞和B淋巴细胞都主要分布于气体交换区的实质中(中插彩版图1H)。

14日龄时，三级支气管肺实质中CD3+T细胞较多，而Bu-1+B细胞也较多地分布在三级支气管肺实质中，但比CD3+T细胞少。在BALT中，CD3+T细胞的数量仍多于Bu-1+B细胞，而且CD3+T细胞占据中央，而Bu-1+B细胞位于外周(中插彩版图1I)。

2.2 21～90日龄鸡T、B 淋巴细胞的分布规律 21日龄时，BALT特别发达，其中淋巴细胞分布更为密集，数量都显著增加，CD3+T细胞和Bu-1+B细胞数量相当(图2)。肺小叶中，CD3+T细胞较多地分布在呼吸毛细管周围即气体交换区，局部也形成小的淋巴聚集物(中插彩版图3A)，而Bu-1+B细胞则较少，无聚集物形成(中插彩版图3B)。

图2 BALT中CD3+T和Bu-1+B细胞的数量变化Fig.2 The changes of quantity of CD3+T and Bu-1+B cells in BALT

图3 21～90日龄肺脏中T、B淋巴细胞的动态变化 (250×)Fig.3 Development of T and B lymphocytes in lung at 21～90 day-old (250×)A：21日龄，箭头：气体交换区中小的淋巴聚集体；B：21日龄，箭头：Bu-1+B细胞散布在肺脏实质中；C：35日龄，箭头：BALT中的CD3+T细胞；D：35日龄，箭头：BALT中的Bu-1+B细胞；E：56日龄，箭头：生发中心；F：56日龄，箭头：仅少量CD3+T细胞分布于滤泡间区域；G：56日龄，箭头：CD3+T细胞散布于整个肺小叶中；H：90日龄，箭头：房间隔上形成聚集体；I：90日龄，箭头：气体交换区中的淋巴聚集体A:21-day-old,arrow:small lymphoid aggregates in gas exchange region;B:21-day-old,arrow:Bu-1+B cells scattered in the lung parenchyma;C:35-day-old,arrow:CD3+T cells in BALT;D:35-day-old,arrow:Bu-1+ B cells in BALT;E:56-day-old,arrow:germinal center;F:56-day-old,arrow:less CD3+T cells in the interfollicular area;G:56-day-old,arrow:CD3+T cells scattered in hole pulmonary lobule;H:90-day-old,arrow:lymphoid aggregates in interatrial septa;I:90-day-old,arrow:lymphoid aggregates in gas exchange region

35日龄时，无论是BALT中，还是肺小叶中淋巴细胞的数量都持续增加。BALT中Bu-1+B细胞已经超过CD3+T细胞(中插彩版图3C、3D)。

56日龄时，BALT中形成主要由B淋巴细胞构成的淋巴小结，其中的生发中心周缘界限清楚(中插彩版图3E)。T淋巴细胞分布于淋巴小结周围的滤泡间区域，数量显著少于B淋巴细胞(中插彩版图3F)。肺小叶中，CD3+T细胞在三级支气管气道内壁中、房间隔中、气体交换区和小叶间结缔组织中都都有分布，散布在整个肺脏中(中插彩版图3G)。

90日龄与56日龄的发育状况相似，说明56日龄时已基本发育成熟。此时，房间隔上淋巴细胞都有较多分布，甚至形成聚集物(中插彩版图3H)。气体交换区的呼吸性毛细管和毛细血管周围，有大量淋巴细胞存在，呼吸性毛细管内壁为单层扁平上皮(中插彩版图3I)。

3 讨论

在禽类养殖中，呼吸系统的疾病是影响养殖的疾病之一，给养殖业也带来了很大的经济损失[6]，而且，有几种重要的禽类致病菌会通过肺脏表面进入宿主随后传播到体内的靶器官，如禽流感和新城疫等。因此，动物的健康要取决于对致病菌入侵和在支气管相关黏膜表面及肺脏组织中的复制的有效控制，这也就是说疫苗接种应该能够有效诱导这些部位产生免疫应答，从而有助于阻止致病菌的入侵，实现这个目标的方法之一就是对黏膜表面进行疫苗接种，这个技术在禽类养殖业中已经广泛应用，如滴鼻点眼和喷雾等接种方法[7-8]。为了研制适合鸡使用且可以提供有效免疫保护的黏膜新型疫苗，就需要对鸡肺脏相关免疫系统的结构和功能的有综合的了解。但目前还缺乏有关鸡肺脏相关免疫系统的知识。

对于环境刺激是否是BALT发育的根源这个问题在很大程度上还是未知。早期对于SPF鸡的研究描述了在哈氏腺和支气管中出现淋巴细胞浸润，但是对于肺脏还没有研究。虽然在关于SPF鸡和一般鸡生发中心的发育方面观察到有微小的差别，但两者BALT的发育具有类似的时间特征[9]。除此之外，致病性微生物的感染也会显著的增加BALT生发中心的数量[10]。对于这种反应是源于局部抗原特异性T、B淋巴细胞的介导还是淋巴细胞的迁移还需要进一步的证明。本试验通过免疫组织化学染色方法发现，4日龄时在初级支气管与次级支气管交汇处有淋巴细胞的聚集物，即形成了明显的支气管相关性淋巴组织(BALT)。从此时起，肺脏内的淋巴细胞就以2种形式存在，一是集合性淋巴组织—BALT，另一种就是散布在肺小叶中的弥散性淋巴组织。这与之前的研究相一致：BALT在出生时并不存在，出壳后第4天才开始出现，第4周开始出现分离的T、B细胞区，到第12周可观察到明确的T、B细胞区[11]。但BALT的进一步发育需依赖于抗原，这点与鼻相关淋巴组织(NALT)不同。在形态学上，BALT与NALT不同，淋巴细胞的排列形态和数量具有种属和个体差异。典型的BALT为滤泡样的淋巴细胞聚集，中心为由小淋巴细胞包裹的生发中心。淋巴滤泡主要由B细胞组成，淋巴滤泡间和副滤泡区主要由T细胞组成。在黏膜上皮下的部分称上皮下区或圆顶区，夹杂分布有T细胞和B细胞，其中还分布有高内皮静脉(HEV)，其特点是无纤毛但有膜性突出[2]。此后随着日龄增长，BALT不断发育，其中的各种免疫细胞的数量也在不断发生变化，56日龄时，BALT中形成主要由B淋巴细胞构成的淋巴小结，其中的生发中心周缘界限清楚，有形态较大着色较深的浆细胞存在，此时各种免疫细胞的分布和数量也相对稳定，因此BALT在56日龄时基本发育成熟，具有了参与肺脏局部黏膜免疫发达的结构基础。