顶复门原虫顶质体研究进展

尹德琦，李佳祺，陈虹宇，桑晓宇，杨 娜，冯 颖，陈启军，姜 宁

(沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866)



顶复门原虫顶质体研究进展

尹德琦，李佳祺，陈虹宇，桑晓宇，杨 娜，冯 颖，陈启军，姜 宁*

(沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866)

顶复门寄生虫包括多种细胞内寄生的原虫，能够引起严重的人和动物疾病，其中包括疟疾(疟原虫)、弓形虫病(刚地弓形虫)、巴贝斯虫病(牛巴贝斯虫)、球虫病(艾美尔球虫)及孢子虫病(圆孢子虫)等。顶复门寄生虫含有一个特殊的、不可或缺的细胞器，具有与藻类和植物的叶绿体同源的残留质体，称为顶质体。来源于叶绿体的残留质体保仍保留着一个能够自主复制的35 kb大小的环状DNA。虽然残留质体(顶质体)无法进行光合作用，但它却扮演了一个重要的角色，参与了寄生虫体内脂肪酸、类异戊二烯及血红素的生物学合成。论文从顶质体最初的发现、起源、基因组及生物学功能等方面介绍了顶复门寄生虫顶质体的一些研究进展。

顶复门寄生虫；顶质体；内共生；恶性疟原虫

顶复门(Apicomplexa)包含了许多单细胞真核生物,其中部分寄生虫具有非常重要的临床和经济学意义[1]。顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫，是人和动物的重要病原，能够引起严重的疾病，从而造成巨大的经济损失[2-3]。这些原虫起源于具有光合作用的祖先，虽在进化过程中逐渐失去了光合作用，但在其体内仍发现退化的残留质体。其独特的细胞器——顶质体具有独立的基因组，能够进行基因的复制和表达，在虫体内发挥着重要的生物学功能。因此，研究顶质体对顶复门寄生虫具有重要的意义，现已成为顶复门寄生虫研究的重要热点。

1 顶质体的发现

1975年，由Kilejian A在病鸭体内发现疟原虫的染色体外存在一种环状DNA分子[4]。限于当时的技术条件，且该结构经常与高尔基体联系在一起，因此，在相当长的时期内顶质体又被称为高尔基体附属体、球形体。通过BLAST顶质体35 kb基因序列获得最佳匹配结果显示，这些基因并不属于线粒体基因组，人们才逐渐开始接受这种环状基因可能是来自生物进化过程中的某种遗迹——质体。随着恶性疟原虫35 kb环状基因组测序工作的完成，其结果表明除了缺乏涉及质体的光合作用基因外，具有类似于质体的全部基因。

2 顶质体的起源

顶质体是由内共生方式产生的。研究人员电镜下对顶质体的超微结构进行了进一步的研究，顶质体呈多重膜结构。最初存在的分歧是关于膜的数量，但现在普遍认为有4层膜结构。因为顶质体具备2个以上的膜结构是二次内共生的一个标志，其中质体源自真核生物内共生产生，因此膜的数量对于了解顶质体的进化起源具有重要意义。除了关于膜的数量的争议外，在顶质体是否是由内共生产生的问题上也存在争论。研究人员对此提出了两种观点：一种观点是顶质体来源于绿藻(衣藻或小球藻)，另一种观点是顶质体来自于红藻。然而研究表明基于顶质体基因组的组成及其排列，认为红藻更有可能是顶质体的祖先。

珊瑚共生体(Chromera velia)是一种能够进行光合作用的顶复门寄生虫的祖先，这对于顶复门类寄生虫的起源和进化史的理解具有重要的意义[5]。研究表明Chromera velia生活在珊瑚中，具有4层膜结构且能进行光合作用，与顶复门寄生虫具有较近的亲缘关系。Janouskovec J等[6]认为Chromera velie含有红藻内共生体。因此，顶质体出现在鞭毛藻和顶复门寄生虫之前，可能来源于红藻。有研究认为早期的无脊椎动物有共生体，可能是现代鞭毛藻和顶复门寄生虫的祖先，这些共生体最初应该是能够进行光合作用的。顶复门寄生虫中某个分支在某些阶段失去光合作用，但很大程度上保留质体，就是我们现在知道的顶质体。

这些研究不仅表明所有的顶质体都应该源自于同一个祖先，而且在顶复门寄生虫开始分化之前，顶质体就已经存在于其内，这也意味着在所有顶复门生物体内都有顶质体的存在，但目前发现隐孢子虫是个例外。

3 顶质体的基因组

顶质体具有一个独立的、大小约35 kb的闭合环状DNA分子。顶质体基因组只编码很少一部分与功能相关的蛋白质，如tRNA、rRNA、核糖体蛋白及翻译延长因子TufA等。由DNA序列分析表明，质体DNA含有多个功能编码序列，如多拷贝的rRNA基因等，在进化过程中顶质体中的大部分遗传信息都已转移至核基因组中。

4 顶质体稳定存在于寄生虫中

顶复门寄生虫和鞭毛藻的共同祖先由藻类内共生体产生，藻类大多数是一种能够完全自主、自由生活的真核生物。红藻内共生体在进化过程中逐渐成为顶质体的基因组、基质及4层膜结构等，其4层膜结构包括最原始的红藻质体两层膜、细胞质膜及从宿主的内膜衍生的最外层膜。有研究认为顶质体缺乏含有色素的类囊体膜，这也可能是它们无法进行光合作用的重要原因。

研究认为还原内共生体发生模式至少需要3步：①宿主必须利用的内共生体的营养；②内共生体的分裂受到调控保证其数量；③顶质体作为一个独立细胞器稳定存在于细胞中。第一步主要是通过糖转运蛋白进入内共生体的膜结构中，允许宿主利用其光合作用的产物。有趣的是，当顶复门的祖先进化为寄生虫并不能进行光合作用的时候，质体便不能够提供营养而是要汲取营养。寄生虫的胞液能够给质体提供营养，类似于在黑暗中不能进行光合作用的植物细胞。

内共生分裂的第二步调控比较重要。通过了解植物质体在细胞分裂期间的机制，发现质体主要由原始细菌分裂，通过内共生将大部分基因转移到宿主的细胞核中[7]。在电镜下，分裂中的顶质体总是与中心体相联系，并在其拖拽作用下分裂，然后平均分配到每一个裂殖子中去。通过这些研究发现顶质体的分裂通过与中心体的复制相联系，从而与细胞核分裂保持一致，并与宿主细胞建立了相互依存的关系。

5 顶质体蛋白质的转运

内共生体进化的最后一步是通过某种机制固定在宿主内，逐渐使内共生体失去自主性而依赖于宿主。质体和线粒体都只是部分自主调控，不能独自生存。其固定机制是通过基因转移而丢失内共生体遗传自主性，质体(包括顶质体)已明显失去了宿主细胞的核DNA。这种丢失不是有害的，只要质体仍保留在宿主内，宿主将会提供质体所丢失的质体DNA基因产物。在恶性疟原虫核中约480个顶质体基因来源于内共生体，其编码的蛋白需要靶向到顶质体中才能发挥功能。

质体能够通过核基因编码蛋白和精准的靶向机制发挥生物学功能，顶质体同样如此。靶向定位通过编码的载体蛋白和膜上的转位分子蛋白能够将基因产物送达顶质体中发挥其功能。通过生物信息学对顶质体靶向蛋白进行预测，其具有典型的两部分N端扩展结构，这与恶性疟原虫和弓形虫有所区别。在对初级质体的研究中发现，靶向质体的蛋白在N末端存在着一个转运肽，它通过与质体膜表面的脂类和ToC/Tic(膜外/内表面转运子)蛋白受体作用而进入膜内[8]。这种机制很可能在第2次内共生后得以保留下来。大部分转运肽呈现出极大的冗余性，其中只有一部分肽段起着决定性的作用[9]。

6 顶质体的生物学功能

顶质体发挥着重要的生物学功能。一旦顶质体的功能受到抑制，则会导致虫体的死亡，目前尚未完全清楚其机制。通过分析顶质体基因组中少数基因编码的蛋白证实顶质体的光合作用已经丢失。目前正在进行的刚地弓形虫和恶性疟原虫的基因组计划将为研究顶质体的功能提供重要的价值资源。通过研究顶质体脂肪酸生物合成系统的基因表明顶质体能够生成脂肪酸，驳斥了疟原虫不能合成新的脂肪酸的观点。事实证明，疟原虫在红内期的脂肪酸含量不明显，而之后的感染周期中含量明显增多。从基因组数据分析中发现顶质体还包括异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)生物合成途径，类异戊二烯化合物的前体为异戊烯基化蛋白质、泛醌、多萜醇等[10-11]。随后的研究表明疟原虫的顶质体除了能够产生铁硫络合物，还能与线粒体共同作用参与血红素的合成。

研究发现位于质膜上的质体样转运蛋白(plastidic phosphate translocators,pPT)，具有类似于植物中的质体能够还原碳化合物的作用[12]。在弓形虫中敲除顶质体转运基因，可立即导致虫体死亡[12]。奇怪的是，在疟原虫顶体中，有两种pPT型的转运因子位于不同的膜上，研究表明在外膜上的转运因子是必要的，但在伯氏疟原虫内膜中pPT是可有可无的[13]。总而言之，顶质体与非光合植物或藻类质体的作用方式相类似，它不仅是顶复门寄生虫中唯一合成脂肪酸的方式，还参与了类异戊二烯和血红素的生物合成。

7 顶质体的生物学意义

当顶质体首次被发现时，作为治疗寄生虫的新靶标引起人们的关注。顶质体本质上是一种内共生体，是具有能够自主复制和表达的环状DNA分子。许多抗菌药靶向其复制和表达的过程，如克林霉素，阿奇霉素及多西环素等药物被用于疟疾的治疗或预防。研究表明顶质体的Ⅱ型脂肪酸生物合成酶(fatty acid synthase Ⅱ，FASⅡ)系统被发现时，一度成为药物治疗寄生虫的热门靶点。一系列报道描述了各种FASⅡ抑制剂作为杀灭寄生虫的潜在药物，后来的研究表明并非如此[14]。以FASⅡ中的酶作为潜在的靶点，随着基因敲除技术研究表明疟原虫在红内期没有参与脂肪酸生物合成途径中重要的酶，这表明寄生虫在这个阶段不需要合成脂肪酸[15]。然而，对于啮齿动物的疟疾感染的肝脏阶段和对于恶性疟原虫感染人类的卵囊阶段，顶质体的脂肪酸生物合成途径都是至关重要的。

此外，是否可以利用FASⅡ靶向感染疟疾的啮齿动物的肝脏代谢阶段来达到预防疟疾的目的，研究人员认为虽然在恶性疟原虫感染的血液阶段，顶质体FASⅡ和血红素的合成的途径是非必需的，但是在感染啮齿动物和人类的疟原虫中，参与血红素生物合成酶类对于卵囊的发育具有重要的作用[16-17]。因此，靶向顶质体的血红素的合成途径和FASⅡ都具有抗寄生虫活性的作用。

8 顶质体的缺失

通过基因敲除技术的研究证明，FASⅡ和血红素生物合成途径在寄生虫感染血液阶段似乎是不必要的，Fe：S簇合物的作用被广泛认为是一种具有还原性等价物。顶质体在寄生虫感染的血液阶段发挥着参与IPP生物合成的作用。此外，类异戊二烯前体的生物合成是通过原核生物的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途径完成的，是顶复门寄生虫唯一保守的生物合成途径。巴贝斯虫和泰勒虫也含有顶质体，但它们基因组缺乏合成Ⅱ型脂肪酸、血红素生物的基因及合成所需的Fe：S簇合物的suf基因[18]。值得注意的是，巴贝斯虫和泰勒虫中顶质体代谢作用的减弱表明，疟原虫的顶质体在感染血液阶段的功能也可能会受到限制，因为这些生存在血细胞中的顶复门寄生虫只需要完整的类异戊二烯前体生物合成途径和Fe：S簇生物合成途径，后者是在MEP途径中只提供相关酶的辅助因子，因此本质上只需要MEP途径。

研究发现可通过生物化学途径去除疟原虫的顶质体。进一步的进化证据表明，隐孢子虫属寄生虫在进化过程中顶质体已经丢失。Dahl E L等[19]已经确定通过抗生素(如多西环素)抑制顶质体基因组的表达，能够破坏顶质体在细胞分裂期间的复制和遗传。值得注意的是，将IPP生物合成类异戊二烯前体的产物添加到培养基中，这些缺乏顶质体的寄生虫能够存活。或许IPP在功能上可以取代顶质体，由此可见顶质体在疟原虫的血液阶段必须要合成类异戊二烯的前体来保证虫体的存活。IPP存在可以使任何具有顶质体功能障碍寄生虫得以存活，使其成为研究抗疟药的潜在靶点，甚至是成为探究某些必需基因产物(SufC、铁硫络合物)的工具[20]。目前认为IPP对恶性疟原虫寄生虫的体外培养有较好作用，但所要求的IPP水平非常高。如果培养基中IPP的浓度高，则表明寄生虫的吸收能力差，此方法有待于进一步探究。

顶质体的产生是内共生体进化过程中的壮举，复杂的细胞通路都需要它的维持，一旦失去顶质体，难以想象其后果。通过研究在不同的生物体中次生质体光合作用的丢失、基因组及质体细胞器等，表明质体的存在与类异戊二烯前体的生物合成有密切关系[21-22]。与疟原虫中其他生物合成途径血红素和FASⅡ相比，类异戊二烯前体是疟原虫完成生命周期不可或缺的，使疟原虫能够从一个宿主感染下一个宿主。因此，在疟原虫找到替代足够量的IPP、血红素及脂肪酸的方法之前，顶质体都将是不可或缺的。

顶质体的IPP合成对恶性疟原虫的配子生成和卵囊形成来说是必不可少的[23]。那么IPP合成在疟疾感染人类的肝阶段是否是必不可少的呢？是否可以作为药物治疗的靶点？尽管顶质体在疟原虫的红内期仅具有产生IPP的单一功能，但是该途径已成为治疗急性疟疾和其他顶复门寄生虫(除了隐孢子虫)感染的潜在靶点。值得注意的是，顶复门寄生虫的顶质体合成类异戊二烯前体对顶复门寄生虫的生存有重要的作用。有研究认为膦胺霉素对于伯氏疟原虫感染肝脏期有治疗效果[24]。膦胺霉素能够有效地的降低疟原虫的存活率，其衍生物-FR900098具有更高的活性[25]。这些药物对于临床应用具有潜在的价值。Guggisberg A M等[26]对膦胺霉素的耐药性方面也进行了研究，出乎意料的是，耐药性与膦胺霉素作用的1-脱氧木酮糖-5-磷酸异构酶无关。

9 展望

自顶质体被发现以来，对顶质体的研究一直都在继续，它的出现对研究顶复门寄生虫有着极其重要的意义。在顶质体的漫长进化过程中可能会导致质体的部分功能丢失，但它对于寄生虫的生存仍有着不可或缺的作用。人们逐渐了解顶质体的同时，面对的是更多的未知。顶质体除了被证实参与了脂肪酸、血红素以及类异戊二烯的合成外，其合成过程中的调节机制有待进一步研究。为了减少寄生虫对人类和动物的危害，关于顶质体的一系列问题都需要进一步研究。

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Advance in Apicoplast of Apicomplexan Parasites

YIN De-qi，LI Jia-qi，CHEN Hong-yu，SANG Xiao-yu，YANG Na，FENG Ying， CHEN Qi-jun，JIANG Ning

(ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang,Liaoning,110866，China)

Members of the phylum Apicomplexa are intracellular parasitic protozoa.These are responsible for many devastating diseases including malaria (Plasmodiumspp.),toxoplasmosis (Toxoplasmagondii),babesiosis (Babesiabovis),eimerias (Eimeriatenella) and cyclosporiasis (Cyclosporacayetanensis),et al.The parasitic Phylum Apicomplexa possess a vestigial plastid homologous to the chloroplasts of algae and plants.Most Apicomplexans contain a unique and essential organelle called the apicoplast.Derived from an ancient chloroplast,the apicoplast replicates and maintains a 35 kb circular genome.The plastid (known as the apicoplast) is nonphotosynthetic and very much reduced,but it may play an essential role in parasite maintenance,and participate in biosynthesis of fatty acid,isoprenoids and heme.Here we reviewed the discovery of the apicoplast,and recounted the major advanced insights into apicoplast origin,genome,biogenesis and function.

Apicomplexan parasites; apicoplast; endosymbiosis;Plasmodiumflaciparum

2017-01-14

沈阳农业大学人才引进项目(8804-880416076)

尹德琦(1992-)，男，辽宁大连人，硕士研究生，主要从事于寄生虫学研究。*通讯作者

S852.739

A

1007-5038(2017)07-0091-05