夏蛎金消颗粒的质量控制方法研究*

河北中医学院第一附属医院肿瘤二科

范焕芳 闫娇娇△ 李国川△△ 马 盼 李德辉 韩长辉 王峥嵘 王 骁 魏莉瑛(石家庄 050011)

提要 目的：建立夏蛎金消颗粒的质量控制方法，为该制剂的质量控制标准提供依据。方法：采用薄层色谱法(TLC)对颗粒处方中陈皮、黄芪、石见穿、当归、紫菀、甘草进行鉴别；高效液相色谱法(HPLC)对橙皮苷进行含量测定、方法学验证。结果：TLC法分离度高，展开效果好，阴性无干扰；橙皮苷对照品含量在1.015～5.075 μg之间时与峰面积线性关系良好，精密度、稳定性、重复性试验RSD值均小于2.0%，加样回收试验RSD值为0.77%，平均回收率为98.17%。3批夏蛎金消颗粒中橙皮苷含量分别为1.37、1.38、1.48，平均RSD值为1.28%。结论：该方法准确、稳定，重现性高，可为夏蛎金消颗粒的质量标准提供实验依据。

夏蛎金消颗粒是河北省中医院肿瘤二科治疗肺癌的中药复方制剂，由清半夏、陈皮、茯苓、石见穿、牡蛎、黄芪、沙参、当归、蜜紫菀、蜜款冬花、猫爪草、川贝母、生甘草13味中药组成，具有化痰解毒、益气养阴的功效，长期临床研究表明，夏蛎金消颗粒能明显改善肺癌患者咳嗽、咳痰、胸痛等症状，并且降低化疗后毒副反应[1]。夏蛎金消颗粒在临床应用广泛、疗效确切，但目前缺乏标准的质量评价，为了进一步明确其中的有效成分、含量，建立全面可靠的质量控制方法，本研究除利用薄层色谱法(TLC)对颗粒处方中陈皮、黄芪、石见穿、当归、紫菀、甘草进行定性鉴别外，还采用高效液相色谱法(HPLC)对颗粒中含量丰富、专属性强的指标性成分橙皮苷进行定量分析，为夏蛎金消颗粒的质量标准提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 KQ2200E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，ZF-90型暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，DK-98-II型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，FA2104N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，LC-15C岛津液相色谱仪(苏制05000111号)。

1.2 药品与试剂 橙皮苷(批号110721-201014，20 mg)、黄芪甲苷(批号110781-201717，20 mg)来自中国药品生物制品检定所。对照药材：当归(批号120927-201617，0.5 g)、紫菀(批号120956-200504，2 g)、甘草(批号120904-201620，1 g)、黄芪(批号120974-201612，1 g)、石见穿(批号121579-201001，10 g)，均来自中国食品药品检定研究院。夏蛎金消颗粒样品(批号：20190305、20190315、20190326)及阴性对照所用药材均来自河北省中医院。乙腈、磷酸均为色谱纯，水为蒸馏水，乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、甲酸、三氯甲烷、甲苯、正己烷等试剂均为分析纯。

1.3 实验用薄层板 (1)硅胶G板(青岛海洋化工厂)；(2)自制含羧甲基纤维素钠(CMC)的薄层板：取5 g CMC，缓慢加入盛有1 000 mL蒸馏水的三角瓶中，置于磁力搅拌器上，温度70 ℃～80 ℃，转速适中，溶解后静置。按硅胶G∶上述溶液=1∶3的比例，用自动薄层制板器制成厚度4 mm，20×10 cm的薄层板，晾干，于105 ℃烘干，放置干燥箱中；(3)自制含1%氢氧化钠的薄层板：取上述(2)中制备好的溶液100 mL，加入1%氢氧化钠，溶解后，其余方式同(2)。

2 薄层鉴别方法及结果

2.1 夏蛎金消颗粒的制备 夏蛎金消颗粒采用的是传统湿法制粒，生药加8倍水，煎煮2次，每次2 h，药液浓缩后经60%乙醇沉淀、喷雾干燥，加辅料糊精、润湿、过筛即得[2]。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 陈皮的薄层色谱鉴别[3]：取3批次颗粒细粉各5 g，加甲醇50 mL，充分震荡使其混匀，放置水浴上加热回流30 min，滤过，滤液蒸干后，加入5 mL甲醇溶解残渣，制备供试品溶液；取不含陈皮的阴性药材，同法制成阴性对照溶液；另称取0.407 5 g橙皮苷对照品，加1 mL甲醇，制成浓度为0.407 5 mg/mL的对照品溶液。吸取供试品溶液2 μL、阴性对照溶液2 μL、对照品溶液3 μL，在硅胶G薄层板上点样，展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1.5∶1)，展距约7 cm，晾干后喷三氧化铝显色剂，放置于紫外线(365 nm)下检视，对照品色谱、供试品色谱在相同位置上，显示相同颜色的斑点，阴性无此斑点，见图1。

注：1～3.三批次供试品；4.阴性对照；5.橙皮苷对照图1 陈皮薄层色谱图

2.2.2 黄芪的薄层色谱鉴别[4]:取3批次颗粒细粉各5 g，加入30 mL 50%甲醇，30 min超声处理，纱布滤过，滤液蒸干，以50 mL水溶解残渣后，移入分液漏斗中，用水饱和的正丁醇溶液50 mL萃取2次，合并萃取液，用50 mL氨试液洗涤2次，取正丁醇液，滤过，滤液蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作供试品溶液；取不含黄芪的阴性药材、黄芪对照药材5 g，参照供试品溶液配制方法制成阴性对照溶液、对照药材溶液。另取黄芪甲苷2 mg，加甲醇2 mL，制成浓度1 mg/mL的对照品溶液。吸取供试品溶液5 μL、阴性对照溶液2 μL、对照药材溶液3 μL、黄芪甲苷对照品溶液10 μL，在自制的以羧甲基纤维素钠(CMC)为黏合剂的硅胶G薄层板上点样，展开剂为氯仿∶甲醇∶水(14∶5∶1)的下层溶液，展距约9 cm，显色剂为10%硫酸乙醇，105 ℃加热至斑点显色清晰，后置于紫外线(365 nm)下检视，供试品色谱在与黄芪对照药材、黄芪甲苷对照品色谱相同位置上，显示颜色相同的主斑点，阴性无此斑点，见图2。

注：1～3.三批次供试品；4.阴性对照；5.黄芪对照药材；6黄芪甲苷图2 黄芪薄层色谱图

2.2.3 石见穿的薄层色谱鉴别[5]:取3批次颗粒细粉各5 g，加30 mL 75%甲醇，置水浴加热回流1 h，滤过，蒸干滤液，残渣加入3 mL 75%甲醇溶解，作供试品溶液；取不含石见穿的阴性药材、石见穿对照药材5 g，按照上述供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液、对照品溶液。分别吸取上述溶液2 μL，在硅胶G薄层板上点样，展开剂为乙酸乙酯-三氯甲烷-甲苯-甲醇-甲酸(5∶3∶2∶1∶2)，展距约10 cm，显色剂为三氯化铁-铁氰化钾试液，于日光下进行检视，供试品色谱在与石见穿对照药材色谱相应位置上，显示颜色相同的主斑点，阴性无此斑点，见图3。

2.2.4 当归的薄层色谱鉴别[6]:取3批次颗粒细粉各5 g，加入30 mL正己烷，30 min超声处理，滤过，将滤液浓缩到2 mL，作供试品溶液；取不包含当归的阴性药材、当归对照药材0.25 g，参照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液、对照品溶液。吸取供试品溶液30 μL、阴性对照溶液2 μL、对照品溶液2 μL，在硅胶G薄层板上点样，展开剂为正己烷-乙酸乙酯(8∶1)，展距约7 cm，放置于紫外线(365 nm)下检视，供试品色谱在与当归对照药材色谱相应位置上，显示颜色相同的斑点，阴性无此斑点，见图4。

注：1～3.三批次供试品；4.阴性对照；5.石见穿对照药材图3 石见穿薄层色谱图

注：1～3.三批次供试品；4.阴性对照；5.当归对照药图4 当归薄层色谱图

2.2.5 紫菀的薄层色谱鉴别[7]:取3批次颗粒细粉各5 g，加25 mL甲醇，超声处理30 min，滤过、滤液蒸干，残渣加入1 mL乙酸乙酯溶解，作供试品溶液；取不含紫菀的阴性药材、紫菀对照药材0.25 g，按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液、对照品溶液。分别吸取供试品溶液15 μL、阴性对照溶液15 μL、对照品溶液5 μL，在自制的以CMC为黏合剂的硅胶G薄层板上点样，展距约9 cm，喷10%硫酸乙醇显色剂，105 ℃加热至斑点清晰，放置于紫外线(365 nm)下检视，供试品色谱在与紫菀对照药材色谱相应位置上，显示颜色相同的主斑点，阴性无此斑点，见图5。

2.2.6 甘草的薄层色谱鉴别[8]:取3批次颗粒细粉各5 g，加入25 mL乙醚，置水浴上加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加入5 mL甲醇溶解，作供试品溶液；取不含甘草的阴性、甘草对照药材0.5 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液、对照品溶液。吸取供试品溶液30 μL、阴性对照溶液8 μL、对照品溶液5 μL，在自制的含1%氢氧化钠的硅胶G薄层板上点样，展开剂为醋酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)，充分饱和15 min，展距约8 cm，以10%硫酸乙醇为显色剂，105 ℃加热至斑点清晰，放置于紫外线(365 nm)下检视，供试品色谱在与甘草对照药材色谱相应位置上，显示颜色相同的斑点，阴性无此斑点，见图6。

注：1～3.三批次供试品；4.阴性对照；5.紫菀对照药材图5 紫菀薄层色谱图

注：1～3.三批次供试品；4.阴性对照；5.甘草对照药材图6 甘草薄层色谱图

3 含量测定方法及结果

3.1 色谱条件 色谱柱：C18柱(5 μm，4.6×200 mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(20%∶80%)；检测波长为283 nm；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2 000；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

3.2 溶液制备 (1)对照品溶液：称取适量橙皮苷对照品，放置于容量瓶中，加适量甲醇，超声5 min，加甲醇定容至10 mL，过水滤膜，制成质量浓度为0.14 mg/mL的对照品溶液。(2)供试品溶液：取供试品颗粒，研磨后过80目筛，取细粉1 g，加水适量，超声5 min，定容至25 mL，取上清液，过水滤膜，即得。(3)阴性对照溶液：取不含陈皮的阴性对照，阴性对照溶液制备方法参照上述供试品溶液。

3.3 专属性考察 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，阴性对照色谱图中显示，在与对照品溶液、供试品溶液色谱图的橙皮苷峰相应位置处无相同吸收峰，结果表明专属性良好，结果见图7。

注：A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.橙皮苷图7 HPLC图

3.4 线性关系考察 取橙皮苷对照品适量，加甲醇溶解并定容至10 mL，配制浓度为203 μg/ mL的橙皮苷对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，设定分别进样5、10、15、20、25 μL，以对照品含量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：y=336 353.62x-20 388.7(r=0.999 9) ，说明在对照品含量在1.015～5.075 μg之间，与峰面积线性关系良好，结果见表1、图8。

表1 线性试验结果

图8 标准曲线图

3.5 精密度试验 取浓度为0.14 mg/mL的同一对照品溶液，进样量为10 μL，重复测6次，计算峰面积，最终得到橙皮苷峰面积的RSD值为0.798%，结果表明，设备精密度良好。

3.6 稳定性考察 称取同一批次颗粒细粉1 g，加水超声处理，定容至25 mL，于0、2、4、8、12 h分别进样10 μL，测定其峰面积，计算出RSD值为1.351 8%(n=5)，结果表明样品溶液在12 h内稳定。

3.7 重复性考察 称取同一批次颗粒细粉1 g，加水超声处理，定容至25 mL，平行6份，分别进样10 μL，计算橙皮苷峰面积，得出RSD值为0.85%(n=6)，结果表明该测定方法重复性良好。

3.8 加样回收实验 精密称取同一批次颗粒细粉9份，每份约0.25 g，每份样品加入适量橙皮苷对照品溶液，加水定容至5 mL，进行含量测定，计算加样回收率，结果详见表2，平均回收率为0.981 7%，RSD值0.77%(n=9)，加样回收率符合要求，该方法回收率良好。

3.9 3批样品含量测定 取3批次样品颗粒，按“3.2溶液制备”方法配制供试品溶液，对3批次供试品溶液中(批号：20190305、20190315、20190326)橙皮苷进行含量测定，结果见表3。从3批次橙皮苷含量可见，每克样品颗粒中橙皮苷含量在1.37～1.48 mg，含量相对稳定，但考虑到制备工艺、药品存放时间等因素的影响，按含量下降幅度20%计算，每克样品中橙皮苷含量不得低于1.09 mg。

表2 加样回收试验结果 (mg)

表3 3批样品含量测定 (mg/g)

4 讨论

4.1 薄层色谱法(TLC) TLC在《中华人民共和国药典》中应用普遍且逐渐完善，在中药质量控制中直观、显著、分离速度快，占据重要位置[9]。《中华人民共和国药典》2020年版中有陈皮、黄芪、当归、紫菀、甘草的薄层鉴别方法，但因剂型、制备工艺及药物相互作用的影响，操作步骤也不能单纯套用，本方法在薄层板的选择、点样方式、展开剂选择方面进行改良，最终得到了分离度高、重现性好的薄层色谱。

在黄芪、紫菀、甘草的薄层鉴别中，初期色谱均出现拖尾，展出效果差，结合薄层板硅胶性质、黏合剂、pH值的差异，最终选用自制含CMC的硅胶G板、1%氢氧化钠的硅胶G板，结果斑点清晰。在黄芪、紫菀薄层鉴别中，点样方式根据多次显色结果进行调整，由圆点点样改为横线少量多次点样，此方法分离度高，斑点清晰，无明显拖尾[10]。当归的薄层鉴别时，将极易挥发的乙醚改为用正己烷超声提取，正己烷-乙酸乙酯为展开剂，在此条件下，斑点分离清晰，无阴性干扰。黄芪展开剂选择氯仿∶甲醇∶水的下层溶液，展开剂比例13∶7∶2，存在斑点重叠现象，最终调整为14∶5∶1，最终发现在此条件下，斑点分离度好，无阴性干扰。

4.2 高效液相色谱法(HPLC) 陈皮、半夏之二陈汤，具有理气健脾、燥湿化痰的功效，为治痰之代表方剂，也被广泛作为基础方化裁，应用于肺癌的基础及临床研究中[11-13]。陈皮中含有多种丰富的化学成分，如黄酮类、萜类与挥发油、生物碱类等，有减少炎症损伤，改善微循环，保护肺组织细胞等作用[14]。陈皮中指标成分橙皮苷含量极高，其有抗癌、抗炎、诱导细胞凋亡的作用[15]。在前期制粒工艺实验中，就以橙皮苷为考察指标，在保证出干膏率同时最大程度兼顾到夏蛎金消颗粒中的有效成分[2]。测定证实，陈皮的指标成分橙皮苷提取工艺简便，专属性高、含量稳定且无阴性成分的干扰，能有效确保颗粒中有效成分达标、质量稳定。

色谱条件选择：在200～400 nm波长段对橙皮苷对照品、供试品溶液进行扫描，结合相关研究[16]，橙皮苷检测波长为283 nm时有最大吸收。流动相参考《中国药典》及有关文献研究，考察甲醇-水、乙腈-磷酸、乙腈-水等系统，最终发现流动相为乙腈-0.1%磷酸(20%∶80%)时，分离效果良好，峰形对称[17]。

提取溶液选择：HPLC进行橙皮苷的含量测定时，分别采用50%甲醇、水2种方式对样品进行处理，对比发现水比50%甲醇溶解性好，两者所测得积分面积差异不大，考虑到颗粒本为水溶性物质，又处于安全性的考虑，故采用水提取的方式，经验证，本研究所建立方法，专属性强，线性关系及重复性良好，精密度、稳定性良好。

综上所述，本研究利用TLC、HPLC对夏蛎金消颗粒进行定性、定量分析，该方法可操作性强、重复性好、应用广泛，可为夏蛎金消颗粒的标准质量控制提供实验依据。