不同脱脂试剂对家兔骨骼标本脱脂效果的影响

2022-10-27 07:35牟思洋王向群星宗伯李伟琪聂凡皓于雷
现代畜牧兽医 2022年9期
关键词:氢氧化钾脱脂脂肪酶

牟思洋,王向群,星宗伯,李伟琪,聂凡皓,于雷

(青岛农业大学海都学院,山东 烟台 265200)

动物骨骼标本是观察动物体基本结构和形态架构最直接、最简单的施教工具之一[1-3],且在使用过程中具有不受时间和地点局限的优点。动物骨骼标本的制作一般包括剥皮取肉、脱脂、漂白、拼接、保养等环节。由于骨骼的骨骼腔和骨松质中含有一定的脂肪成分,且脂肪往往存在于骨骼内部或腔隙过小的部位。若处理不当,脂肪便会慢慢溢出,使骨骼发黄、发黑,影响美观,进而缩短骨骼标本的使用寿命。因此,脱脂是骨骼标本制作中至关重要的环节[4]。目前,骨骼标本制作使用的脱脂试剂多为氢氧化钠(NaOH)等碱性试剂,尽管脱脂效果佳,但其具有的腐蚀性对致密程度较低的骨骼破坏性较大[5]。脂肪酶可水解甘油三酯等油性物质,可催化酯水解、酯合成、酯交换等有机反应[6-8],目前主要应用于皮革等物品的脱脂[9-10],但关于脂肪酶在骨骼标本制作中脱脂的应用与研究尚未见报道。本研究选取了脂肪酶、氢氧化钠、丙酮、氢氧化钾等4种试剂对家兔骨骼进行脱脂处理,以了解脂肪酶在骨骼标本中的脱脂效果,为骨骼标本的制作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择成年健康家兔4只,购自山东省莱阳市某活鸡店,平均体重约2.5 kg,取下四肢,分别记为1、2、3、4号。

1.2 试验仪器

解剖盘、手术刀、手术剪、电磁炉、铁锅、电子天平等均由青岛农业大学海都学院基础兽医学实验室提供。

1.3 试验试剂

胰蛋白酶(国药集团)、脂肪酶(北京鸿润宝顺生物科技有限公司)、丙酮溶液(青岛农业大学海都学院基础兽医学实验室)、3%过氧化氢溶液成品(山东利尔康医疗科技股份有限公司)、10%氢氧化钾溶液(福州飞净生物科技有限公司);其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.4 试验方法

1.4.1 家兔处死

家兔提前禁食1 d,为最大程度降低家兔骨骼损伤采用空气栓塞法处死。

1.4.2 剥皮去肉

在避免损伤骨骼的基础上,分离死亡的家兔四肢与躯干。四肢毛皮环切剥下,剔除大块肌肉、组织等附着物。家兔骨骼按照不同兔子的前肢、后肢分组浸泡于胰蛋白酶溶液内,浸泡1~2 d后取出,清水洗净、晾干。其中胰蛋白酶溶液按照胰蛋白酶∶蒸馏水=1∶500的比例配制。

1.4.3 脱脂

4只家兔的四肢依次放入饱和脂肪酶、丙酮、3%氢氧化钠和3%氢氧化钾溶液中进行脱脂。其中饱和脂肪酶置于37℃恒温箱中以保持酶的活性,其余试剂在室温下脱脂。记录在相同时间内4种脱脂剂的脱脂效果。于脱脂后的8、16和24 h观察并记录骨骼色泽、洁白度、骨骼松弛度、残留附着度及骨骼表面油脂浸出等情况。待观察记录完毕后将骨骼洗净,晾干。

1.4.4 漂白

使用3%过氧化氢对脱脂后的骨骼进行漂白,浸泡24 h观察并记录骨骼及韧带完整性、颜色和光泽度。漂白完成后,重复清洗2~3次,阴干,观察记录最终漂白效果。1.4.5保存

在常温和保持通风的条件下,漂白后的骨骼于阴凉干燥处避光保存150 d后观察期保存效果。

2 结果与分析

2.1 4种试剂处理家兔骨骼的去肉效果(见图1)

由图1可知,胰蛋白酶对于骨骼上的软组织处理效果较好,除少部分难以消化的筋外,骨骼表面肌肉、角质化物质柔软易去,经冲洗后均脱落,骨骼缝隙的细小肉丝也已去除干净。晾干后,骨体表面开始有油脂浸出,呈黄白色交替,且骨股头出现黑色骨髓沉积。

图1 4种试剂处理家兔骨骼的去肉效果Fig.1 Meat removal effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

2.2 4种试剂处理家兔骨骼的脱脂效果(见表1)

由表1可知,脂肪酶在24 h脱脂后可达到预期效果,脱脂充分且骨骼未遭到损伤;丙酮在24 h后未达到预期效果,骨骼无损伤但脱脂不充分;3%氢氧化钠溶液和3%氢氧化钾溶液在24 h后脱脂达到预期效果,脱脂充分但骨骼的硬度和质地存在一定损伤。

表1 4种试剂处理家兔骨骼的脱脂效果Tab.1 Degreasing effect of four kinds of reagents on rabbit bones

2.3 4种试剂处理家兔骨骼的漂白效果(见图2、表2)

图2 漂白后的家兔骨骼Fig.2 Rabbit bones after bleaching

由图2、表2可知,从骨体完整度角度考虑,经脂肪酶、丙酮脱脂后的骨骼再经过氧化氢漂白后,骨体坚硬无损伤;氢氧化钠及氢氧化钾脱脂后的骨骼经漂白后均有不同程度的损伤,如裂隙、硬度下降等。从骨骼颜色角度考虑,经脂肪酶脱脂的骨骼颜色发白,光泽发亮,附着污物少。综合整体考虑,使用脂肪酶脱脂的骨骼经漂白后的骨体完整度和骨骼颜色最优。

表2 家兔骨骼漂白后效果比较Tab.2 Comparison of effects of rabbit bones after bleaching

2.4 4种试剂处理家兔骨骼的保存效果(见表3)

由表3可知,由于前期脱脂时经过间较短,仍存在部分油脂渗出情况,但脂肪酶在油脂渗出最少的情况下仍保持着骨质完整度高、骨质好、骨骼较白的效果。丙酮虽然达到脱脂目的但完成度不及脂肪酶,且整体泛黄。氢氧化钠和氢氧化钾不仅油脂渗出和脂肪残留较上述两种试剂多,而且腐蚀痕迹严重。

表3 4种试剂处理家兔骨骼的保存效果Tab.3 Preservation effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

3 讨论

3.1 试验动物的选取

制作骨骼标本前,应注意家兔的年龄和体型。家兔年龄过小、过大或体型瘦弱、发育不良,制作的骨骼易出现形态结构不明显或骨质脆弱的现象,进而导致骨骼标本最后价值受到影响[5]。而家兔体型过于肥胖或年龄过大,附着在骨骼上的脂肪多于正常体型的家兔,将延长骨骼脱脂的时间,加大试剂使用剂量,还提高了脱脂不到位的风险。

3.2 腐蚀去肉的方法

骨骼标本制作方法中,传统的虫噬法、土埋法等制作周期过长且污物残留较难清洗干净[11],化学试剂腐蚀法多选用氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液虽然可以很大程度地软化水解蛋白质,但经过人工剔除的骨骼大部分骨体裸露,氢氧化钠对骨骼具有一定的直接腐蚀作用。

本研究中使用胰蛋白酶进行腐蚀去肉,胰蛋白酶可催化水解碱性氨基酸所形成的肽键,有效去除骨骼附着肌肉及残留物[12]。与传统的虫噬法以及氢氧化钠浸泡法相比,蛋白酶不会对骨骼本身产生不可逆的影响,可最大限度地保留骨骼的完整性,避免了对骨骼的伤害且缩短了制作周期。胰蛋白酶对人的伤害性低[13],对环境无污染,无需担心废液排入下水道造成污染的问题。

3.3 不同脱脂剂的本身特性及脱脂效果

不同脱脂试剂的选择均以最大程度析出骨体内的油脂成分,且尽可能不损伤骨骼本身为标准。吴坤成等[14]的研究表明,工业环己酮、工业乙酸乙酯、工业丙酮、天那水等试剂具备较好的脱脂效果,但均存在易燃、刺激性强等问题,且工业环己酮为3类致癌物,存在致癌的风险。

本研究选用4种脱脂试剂:脂肪酶、丙酮、氢氧化钠、氢氧化钾,在不同的时间段观察其对骨骼的影响,作用效果也不同。有机溶剂丙酮是一种易溶于水且溶解度高的试剂,制作时利用丙酮对脂肪萃取的作用可实现分离骨组织与脂肪的目的[15]。由于丙酮对骨骼自身无影响,经浸泡脱脂后的骨骼完整性、硬度均无较大变化,油脂析出量符合脱脂标准,但丙酮存在刺激性强、气味重的缺点。

氢氧化钠与氢氧化钾属于强碱类物质,可与甘油三酯等油脂类物质发生皂化反应,使油脂水解脱出,但易腐蚀骨骼,损伤其完整性。经浸泡脱脂后虽油脂析出量符合标准,但骨骼本身完整度与硬度明显下降。

脂肪酶是一种羟基酯水解酶类物质,脂肪酶所具有油-水界面的亲和力,能够在油-水界面上高速率地催化水解不溶于水的脂类物质。本研究表明,脂肪酶具有与丙酮脱脂相似的优点,即浸泡脱脂后的骨骼完整性、硬度均无较大变化,同时脂肪酶还具备丙酮不具备的安全绿色的优点。近年来,也有研究表明,十二烷基苯磺酸钠(C18H29NaO3S,简称LAS)对犬骨骼的脱脂效果良好[4],是一种高效、低毒环保的优质脱脂剂。但与本研究使用的脂肪酶相比,LAS对皮肤具有一定的刺激性[16]。

3.4 脱脂试剂安全性分析

本研究中选用的丙酮属于有毒且易燃的危险品。在漂白过程中,选择过氧化氢作为漂白剂时,若清洗不到位,残留的漂白剂极易与丙酮发生爆炸反应。氢氧化钠、氢氧化钾均属于强碱类物质,具有强腐蚀性,易对骨骼产生不同程度的影响。因此,碱性试剂的使用的浓度和浸泡时间均要求严格控制。本研究中选用的脂肪酶兼具脱脂效果较好、实惠易得、安全系数高等优点。

3.5 环境等外界因素对结果的影响

本试验时间为冬季,导致溶剂作用时间变缓,且制作溶液时较为不便。此外,溶液的作用效果也受到光照、空气流通等因素的影响。丙酮等试剂极易挥发,影响试验效果。脂肪酶的脱脂程度也会受到温度的影响,在不适的温度下无法最大程度上发挥脂肪酶的脱脂效果。因此,在使用脱脂酶的过程中应注意环境的温度,避免由此导致脱脂的效果不佳。

4 结论

本试验结果表明,脂肪酶脱脂的骨骼经漂白后在骨骼硬度、完整度、洁白度等方面均优于其他脱脂试剂。此外,脂肪酶还具有安全稳定、无污染等特点,是一种安全性、实用性、经济性俱佳的骨骼脱脂剂。

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