姜黄素对13月龄罗曼粉蛋鸡卵巢组织结构和Sirt1、Sirt2、Sirt3基因表达的影响

袁翠，苏柳玥，吴倩玲，罗鑫旭，林玉，吴江

（广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

卵巢是影响蛋鸡产蛋性能的重要器官，随着产蛋期延长，蛋鸡卵巢正常的生理功能开始出现功能衰退。姜礼文等[1]研究表明，蛋鸡卵巢功能下降可能与氧化应激加重有关；蛋鸡排卵过程中会产生大量活性氧簇（ROS），连续大量地排卵会抑制卵泡颗粒细胞促性腺激素受体的表达，使卵泡数量下降，影响卵巢正常功能。姜黄素（curcumin）是一种提取自姜科植物姜黄等的根茎中的黄色色素。王晓宁等[2]研究表明，姜黄素对小鼠卵巢氧化应激引起的生殖器官损伤具有保护作用。宋传胜等[3]研究表明，姜黄素作用于产蛋后期的蛋鸡能够显著提高产蛋量。

Sirtuins是一种进化上高度保守的去乙酰化酶类，广泛分布于各类组织器官和细胞，具有不同的亚细胞定位和功能。Sirt1大量存在于胚胎早期和生殖细胞中，与众多基因的转录调控、能量代谢以及调节细胞衰老凋亡的过程密切相关[4]。Sirt2基因在多种组织中表达，表达水平随细胞周期的改变而改变，且在有丝分裂期表达量最高[5]；此外，Sirt2也参加卵母细胞中的纺锤体组织和染色体分离[6]。Sirt3主要定位于生物细胞线粒体中，在代谢旺盛的组织如肌肉、肾脏、肝脏中表达较高[7-8]，在卵巢组织也有发现。而上述基因在姜黄素作用下的蛋鸡卵巢中的变化尚无研究报道，本试验通过在蛋鸡日粮中添加姜黄素，观察蛋鸡卵巢组织切片，并检测Sirt1、Sirt2、Sirt3基因的表达量变化，试验结果为姜黄素调控Sirt1、Sirt2、Sirt3在蛋鸡卵巢中的表达和作用机制研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

13月龄罗曼粉蛋鸡购自广州喜迎珍禽公司。

1.1.2 试验仪器

立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、电子天平（上海冠唯仪器有限公司）、手动移液器（艾本德国际贸易有限公司、赛默飞世尔科技有限公司）、冷冻离心机（扬州曦玛离心机有限公司）、离心机（北京天根生化科技有限公司）、PCR仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）、凝胶成像系统（广州誉维生物科技仪器有限公司）、三恒电泳仪（北京市六一仪器厂）、4℃冰箱（北京福意电气有限公司）、-80℃冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、电子天平（上海冠唯仪器有限公司）、实验室专用超纯净水机（重庆科迪实验仪器有限公司）、微波炉（美的集团有限公司）、光学显微镜（上海山汉光电科技有限公司）等。1.1.3试验试剂

RNA反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）、PCR mix（北京索莱宝科技有限公司）、100 bp DNA Marker（北京索莱宝科技有限公司）、硼酸（广东光华科技股份有限公司）、EDTA（赛默飞世尔科技有限公司）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，上海源叶生物科技有限公司）、琼脂糖（北京兰杰柯科技有限公司）、EB替代品（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、EP管（上海脉诺金属表面处理技术有限公司）、姜黄素（含量95%，郑州天顺食品有限公司）、压榨葵花仁油（山东鲁花集团有限公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验选择21只13月龄罗曼粉蛋鸡，选取1只鸡为对照组（CK组），基础日粮和灌喂4 mL压榨葵花仁油；其余20只鸡在饲喂基础日粮的基础上，按质量体重比进行姜黄素灌喂，分为低剂量组C1组（4 mg/kg）、中剂量组C2组（20 mg/kg)、高剂量组C3组（100 mg/kg)、超高剂量组C4组（500 mg/kg），每组5个重复，每个重复1只鸡。基础日粮配方、饲喂环境和管理与本实验室前期研究相同[9]，试验期为4周。基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平Tab.1 Basic diet composition and nutritional level

1.2.2 样品采集

试验结束后，采用放血的方式处死试验动物，及时取出完整卵巢，PBS溶液清洗干净。获得的卵巢组织切片剪成玉米粒大小，一份放入1.5 mL EP管中，加入4%多基甲烷，4℃冰箱保存；另一份分别置于4个1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存。

1.2.3 卵巢组织切片的制作及HE染色

卵巢迅速放到配制好的Bouin氏固定液中固定72 h，洗净，放入全自动真空组织脱水仪中脱水、透明，取出后进行石蜡包埋、切片。卵巢组织切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染色5 min，冲洗；0.5%盐酸乙醇分化30 s，水浸泡15 min，伊红液染色2 min；70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精，每个梯度脱水1 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明2 min，最后采用中性树脂封固。

1.2.4 PCR的提取及反转录

Trizol法提取RNA，RNA反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）反转录合成cDNA，PCR扩增目的条带。PCR体系（20 μL）：ddH2O 6 μL、cDNA 2 μL、PCRmix 10 μL以及上、下游引物各2 μL。反应程序：94℃预变性3 min，94℃变性30 s；52℃退火30 s，25个循环；72℃延伸1 min；72℃延伸5 min；12℃保存。

1.2.5 基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

采用1%的琼脂糖凝胶电泳液检测PCR产物，电泳电压80 V，时间40 min。电泳结束后，使用凝胶成像系统观察荧光条带。

1.3 数据统计与分析

利用光学显微镜对蛋鸡卵巢组织切片进行观察分析。得到的DNA荧光条带采用Image J软件进行灰度值分析，试验数据采用Excel 2010软件进行处理，再进行T检验分析。结果以平均值和标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 姜黄素对13月龄罗曼粉蛋鸡卵巢组织的影响（见图1～图3）

由图1～图3可知，在光学显微镜下观察卵巢切片，在CK组、C1组、C2组、C3组和C4组的蛋鸡卵巢组织中均发现初级卵母细胞（图2）和次级卵母细胞（图3）。初级卵母细胞周围由一层立方形卵泡细胞包裹，卵泡膜和卵泡腔未形成，次级卵母细胞被多层立方形卵泡细胞所包裹，体积比初级卵母细胞大，未形成卵泡腔。其中C1组和C3组还发现了原始卵母细胞（见图1），卵原细胞周围被一层扁平状的卵泡细胞包裹，无卵泡膜和卵泡腔。CK组卵巢组织中卵泡细胞周围的组织细胞减少，形成大量的空白，但与CK组的初级卵母细胞和次级卵母细胞相比，C1组、C2组、C3组和C4组中的卵巢组织均未形成空白，且卵泡内容物明显增多和着色点也有所增加。

图1 蛋鸡卵巢组织切片HE染色（原始卵母细胞）Fig.1 HE staining of ovary tissue sections of laying hens(primordial oocytes)

图2 蛋鸡卵巢组织切片HE染色（初级卵母细胞）Fig.2 HE staining of ovary tissue sections of laying hens(primary oocytes)

图3 蛋鸡卵巢组织切片HE染色（次级卵母细胞）Fig.3 HE staining of ovary tissue sections of laying hens(secondary oocytes)

2.2 Sirt1基因的PCR检测和相对表达量分析（见图4）

由图4（a）可知，内参基因和Sirt1的扩增条带单一，且清晰可见，位置大小合适。对凝胶电泳后所得出的条带进行灰度分析，得出的各基因检测值除以内参基因，结果见图4（b）。由图4（b）可知，与CK组相比，C1组、C2组Sirt1表达量差异均不显著（P＞0.05），C3组和C4组的Sirt1表达量显著升高（P＜0.05），且C3组高于C4组。

图4 Sirt1基因的PCR检测和相对表达量分析Fig.4 PCR detection and relative expression analysis of Sirt1 gene

结果表明，姜黄素可增加蛋鸡卵巢组织中Sirt1基因的表达量，其中C3组和C4组效果显著（P＜0.05），且以C3组效果更为理想。

2.3 Sirt2基因的PCR检测和相对表达量分析（见图5）

由图5（a）可知，内参基因和Sirt2的扩增条带单一，且清晰可见比较亮眼，位置大小合适。对凝胶电泳后所得出的条带进行灰度分析，得出的各基因检测值除以内参基因，结果见图5（b）。

由图5（b）可知，与CK组相比，C1组、C2组的Sirt2基因表达量显著升高（P＜0.05）；C3组、C4组的Sirt2基因表达量极显著升高（P＜0.01）。

图5 Sirt2基因的PCR检测和相对表达量分析Fig.5 PCR detection and relative expression analysis of Sirt2 gene

结果表明，一定剂量的姜黄素能够有效提高Sirt2基因表达量的影响，其中C3组效果最为理想。

2.4 Sirt3基因的PCR检测和相对表达量分析（见图6）

图6 Sirt3基因的PCR检测和相对表达量分析Fig.6 PCR detection and relative expression analysis of Sirt3 gene

由图6（a）可知，内参基因和Sirt3的扩增条带单一，且清晰可见比较亮眼，位置大小合适。对凝胶电泳后所得出的条带进行灰度分析，得出的各基因检测值除以内参基因，结果见图6（b）。

由图6（b）可知，与CK组相比，C1组、C3组的Sirt3表达量显著提高（P＜0.05），C2组的Sirt3表达量极显著提高（P＜0.01），C4组差异不显著（P＞0.05）。

结果表明，姜黄素可增加蛋鸡卵巢组织中Sirt3基因的表达量，其中C1组和C3组效果显著（P＜0.05），但C2组效果更为理想。

3 讨论

3.1 姜黄素对卵巢组织的影响

姜黄素作为一种提取自姜科植物姜黄等根茎的黄色色素，具有抗氧化、抗炎、保护肝脏和肾脏的功能，且作为动物饲料添加剂无明显的毒副作用[10]。王志[11]研究发现，在日粮中添加姜黄素提高了罗曼蛋鸡血液中钙、磷以及总蛋白和白蛋白的含量，降低了总胆固醇和甘油三酯含量；表明添加姜黄素可提高罗曼蛋鸡的生产性能并改善了蛋品质，且以添加量为200 mg/kg时效果最好。本试验在产蛋后期蛋鸡的基础日粮中添加不同剂量的姜黄素，饲喂一段时间后，通过采集蛋鸡卵巢组织切片观察发现，对照组的蛋鸡卵巢组织出现了一定的机体组织损伤，卵巢组织细胞形成空腔减少，但对比对照组和各处理组鸡的卵巢组织切片，发现4个处理组的卵泡内容物明显增多，着色点增加。由此可知，姜黄素可使产蛋后期蛋鸡的卵巢组织形态发生改变，进一步推测姜黄素对产蛋后期蛋鸡的卵巢具有保护和修复组织形态的可能性。

3.2 姜黄素对蛋鸡卵巢组织中基因表达的影响

3.2.1 姜黄素对Sirt1基因表达的调节作用

有研究发现，姜黄素能够调节哺乳动物卵巢生理机制[12]，提高卵巢抗氧化性能；Sirt1基因在卵巢组织中的表达可延缓卵巢组织细胞衰老和凋亡[13-15]。也有研究表明，Sirt1基因在卵巢中的表达水平下调会增加颗粒细胞的凋亡[16]，但有关姜黄素对调控家禽性器官上Sirt1基因的研究较少见。本试验中，与对照组相比，姜黄素能够不同程度地影响Sirt1基因在蛋鸡卵巢中的表达量，且以C3组和C4组影响最为显著，但C4组的基因表达量低于C3组。结果表明，姜黄素在作为家禽饲料添加剂的使用过程中需要注意用量，使用过量的姜黄素可能会出现反面效果。综上，姜黄素能够提高Sirt1基因在蛋鸡卵巢中的表达，由此可进一步推测，姜黄素能够通过调控Sirt1基因延缓蛋鸡卵巢组织细胞衰老和凋亡。

3.2.2 姜黄素对Sirt2基因表达的调节作用

在基因水平上，Sirt2蛋白表达水平在有丝分裂过程中显著上调，能够显著延长有丝分裂期。在细胞周期的G2/M期，Sirt2丝氨酸的368位点可被细胞周期调节子CDK1磷酸化[17-18]。Sirt2能够参与细胞增殖，为其在多种组织中广泛表达提供了依据，但有关姜黄素对罗曼粉蛋鸡的卵巢组织结构和Sirt2基因表达影响的研究较为缺乏。本试验中，与对照组相比，姜黄素能够不同程度地影响Sirt2基因在蛋鸡卵巢中的表达量，C1组和C2组Sirt2基因的表达量显著升高；C3组和C4组Sirt2基因的表达量极显著升高。结果表明，添加姜黄素可影响13月龄罗曼粉蛋鸡卵巢中Sirt2基因的表达量，使卵巢中Sirt2的表达量有所上调，且添加100 mg/kg姜黄素时效果最为明显。

3.2.3 姜黄素对Sirt3基因表达的调节作用

影响鸡的生长条件因素主要是环境因素所产生的应激反应，可能导致其食欲下降，生产性能降低。鸡出现采食量下降，摄入的能量、维生素及矿物质等营养成分减少，导致鸡生长减慢。大量研究表明，Sirt3不仅可以参与调控机体自身的免疫，还能够调节代谢[19]。本研究中，与对照组相比，姜黄素能够不同程度地影响Sirt3基因在蛋鸡卵巢中的表达量，与CK组相比，C1组和C3组的Sirt3表达量显著提高，C2组的Sirt3表达量极显著提高。结果表明，与对照组相比，添加姜黄素能够提高Sirt3基因表达量，且添加20 mg/kg姜黄素时效果最为明显。

4 结论

本研究结果表明，姜黄素能够改变蛋鸡卵巢组织形态结构，增加卵泡内容物和着色点；与对照组相比，灌喂不同剂量的姜黄素均可提高蛋鸡卵巢中的Sirt1、Sirt2、Sirt3表达量；与对照组相比，C3组、C4组的Sirt1表达量显著提高；C1组、C2组的Sirt2基因表达量显著提高，C3组、C4组的Sirt2基因表达量极显著提高；C2组Sirt3基因表达量极显著提高，C1组、C3组的Sirt3基因表达量显著提高。本试验条件下，姜黄素最优剂量推荐100 mg/kg。