甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎-肠炎模型的建立及验证

杜宝香于钦辉孙启慧王立清杨 勇容 蓉

(山东中医药大学,济南 250355)

现代药理研究发现,流感病毒感染肺组织并在内大量增殖,会造成严重的肺部炎症损伤[1]。临床数据表明,甲型H1N1流感患者早期表现与普通流感相似,包括发热、咽痛、咳嗽、全身酸痛,部分病例表现为呕吐、腹泻[2]。Dogra[3]发现,与普通流感比较,甲型H1N1流感患者的腹泻、呕吐等胃肠道症状较为多见。缪媛媛等[4]曾对1200例普通流感与513例甲型H1N1流感患者的临床症状进行比较研究,结果表明,甲型H1N1流感患者出现胃肠道症状者明显增多。且甲型H1N1确诊病例中腹泻、呕吐等胃肠炎症状多为呼吸道系统的伴随症状。

目前对于小鼠H1N1病毒模型的建立多为单独的肺炎模型[5-6],对于肺炎-肠炎模型的研究报道甚少。本文以BALB/c雄性小鼠为实验动物,滴鼻感染不同浓度的H1N1病毒,筛选出造模的最佳感染浓度,并对其进行多次验证,建立了稳定的肺炎-肠炎模型,为抗H1N1病毒药物的研究提供更加全面的病理模型。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康SPF级雄性BALB/c小鼠36只(4周龄,15～18 g),由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。动物实验在山东中医药大学抗病毒协同创新中心进行[SYKX(鲁)2017-0022],饲养温度(22±2)℃,相对湿度40%～60%,本研究实验方案合理,经本院伦理委员会批准(DWSY202003013),符合实验动物的“3R”原则研究。

1.1.2 病毒

甲型流感病毒H1H1/PR8株,-80℃保存于山东中医药大学抗病毒协同创新中心,使用前在9日龄SPF鸡胚中扩增得到尿囊液,测定血凝效价。使用Reed-Muench法测定病毒毒力,-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

0.9%氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司,批号:D18216041);RNA store样品保存液-DP408、动物组织总RNA提取试剂盒-DP431(RNAprep Pure Tissue Kit)、cDNA反转录试剂盒-KR106、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒-FP205均购自天根公司。

ND-one超微量分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司);荧光定量PCR仪(CFX Connect Real-time System,美国伯乐公司);R583 S、R540IE型呼吸麻醉机(深圳瑞沃德生命科技有限公司);生物安全柜(上海立申科学仪器有限公司,型号:HF safe-1500);高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司,型号:ST-16R)。

1.3 实验方法

1.3.1 流感病毒鸡胚扩增

9～11日龄鸡胚放置37℃孵育箱种孵育1 d,定时翻动鸡胚。选择生长良好鸡胚,于生物安全柜内,画出气室边界和胎位,在胚胎面与气室交届边缘约1 mm处做标记。然后用消毒后的镊子尖头对准鸡胚尿囊腔端打破蛋壳。取病毒液用流水冲浸融化,用生理盐水稀释成不同的浓度,每只鸡胚接种0.1 mL。接种后用无菌棉胶带封口,置于37℃继续孵育48 h。用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔,吸取鸡胚尿囊液,3000 r/min 4℃离心15 min,取上清于-80℃冰箱保存。用0.5%的鸡红细胞测定其血凝效价为1∶320。

1.3.2 Reed-Muench法测定病毒毒力

采用半对数稀释法稀释病毒,稀释的病毒接种于96孔MDCK细胞板,待细胞病变停止后,根据Reed-Muench方法对病毒滴度进行计算,计算出病毒每0.1 mL的TCID50,经测定病毒TCID50=1×105/0.1 mL。

1.3.3 流感小鼠模型的建立

BALB/c小鼠按照体重和肛温随机分成4组(n=6):对照组、流感模型组(10 TCID50组、1 TCID50组、0.1 TCID50组)。3个模型组,按照组别分别滴鼻感染10 TCID50、1 TCID50、0.1 TCID50不同浓度的流感病毒,每只20 μL,对照组小鼠滴鼻接种等量的生理盐水,每天记录小鼠体重、肛温变化,观察小鼠的精神状态、发病及死亡情况。处理后第7天处死小鼠进行取材。

1.3.4 造模指标观察

(1)生理状态观察

接种病毒后,每日观察小鼠肛温、体重变化、大便形状、隐血情况,连续7 d。并参照文献[7]标准,进行DAI评分,评分标准见表1。

表1 DAI评分标准Table 1 DAI score standard

(2)死亡率

计算每组动物的死亡率:死亡率=死亡动物(只)/动物总数(只)×100%

(3)脏器指数

实验结束后,摘取各组动物肺、胸腺、脾等脏器,准确称量并计算脏器指数。

(4)RT-PCR检测肺组织中甲型流感病毒H1N1 M基因及肠组织中ROR-γt的mRNA表达

使用RT-PCR检测肺组织中甲型流感病毒H1N1 M基因及肠组织中ROR-γt的mRNA表达。根据小鼠死亡率、肺部病毒载量及肠道组织中ROR-γt的mRNA相对表达量确定最佳的染毒剂量。实验中所需引物均由生工生物有限公司进行设计并合成。引物序列碱基见表2。严格按照试剂盒说明书完成总RNA的提取、RNA纯度及浓度测定、RNA逆转录为cDNA及相关细胞因子基因相对表达量的检测。

表2 基因序列Table 2 Sequences of the primers

1.3.5 造模结果验证

BALB/c小鼠按照体重和肛温随机分成2组(n=6):对照组、模型组。根据1.3.2项方法,对模型组小鼠滴鼻感染H1N1病毒,感染剂量为上述实验筛选出的最佳病毒剂量。取小肠及肺组织,进行HE染色。利用RT-PCR技术检测肺组织中IL-2、IL-6、IFN-γ、IL-17A及肠组织中GM-CSF、IL-2、IL-6和IL-33的mRNA相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件,数据以平均数±标准差(±s)表示,组件比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)LSD检验,P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 造模实验结果

2.1.1 流感模型小鼠造模指标检测

小鼠滴鼻感染流感病毒后,与对照组小鼠相比,小鼠10 TCID50组、1 TCID50组体重在接种病毒后第3天开始呈下降趋势(图1),出现背弓佝偻、精神不振和软便等现象,在第6天开始两组小鼠出现黏液状粪便,平均DAI评分分别为(2.00±0.00)分和(1.50±0.12)分。而0.1 TCID50组小鼠体重直到第7天才出现下降趋势,且粪便状态一直正常。各组小鼠肛温变化不明显。

图1 各组小鼠体重、肛温和和DAI评分图Figure 1 Body weight, rctal temperature DAI score in eachgroups

2.1.2 各组小鼠死亡率、脏器指数及肺组织中H1N1的M基因mRNA表达

接种病毒后,对照组、0.1 TCID50组小鼠无死亡现象,10 TCID50组小鼠、1 TCID50组小鼠均出现不同数量的死亡。10 TCID50死亡率为67%,1 TCID50组死亡率为17%。与对照组相比,各模型组小鼠肺指数明显升高,胸腺指数明显下降,脾指数无显著性差异。以Ppia为管家基因,分析目的基因的相对表达。与对照组小鼠相比,各模型组小鼠甲型流感病毒H1N1 mRNA相对表达量显著升高(P＜0.05)(见表3)。

表3 各组小鼠死亡率、脏器指数和病毒载量Table 3 The mortality, organ index and viral load of different mice in each group

2.1.3 各组小鼠肠组织ROR-γt mRNA相对表达量

与对照组相比,10 TCID50组、1 TCID50组小肠组织ROR-γt相对表达量显著升高(P＜0.05),0.1 TCID50组虽有升高趋势,但是无显著性差异(图2)。综合各组模型小鼠体重、死亡率、脏器指数、肺部病毒载量及肠道ROR-γt的mRNA相对表达量筛选出最佳染毒剂为1 TCID50。

2.2 造模验证结果

2.2.1 小鼠肺与肠组织病理学指标检测

HE染色结果见图3。结果显示对照组小鼠肺组织呈正常形态,黏膜上皮无变性坏死脱落,管壁及周围组织无炎性细胞浸润、肺泡间隔无增厚。模型组小鼠肺组织见坏死细胞及大量渗出物,周围肺组织结构不清晰,嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润,肺泡壁增厚;小肠组织同样出现小肠绒毛萎缩断裂,淋巴细胞浸润等明显的组织病理学改变,说明小鼠肺及肠道组织出现严重的炎症损伤。

注:与对照组相比,*P＜0.05。图2 各组小鼠ROR-γt基因相对表达量Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Figure 2 The mRNA expression of ROR-γt in four groups

2.2.2 小鼠肺组织细胞因子的基因表达

与对照组相比,模型组小鼠肺组织中细胞因子IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的相对表达量均显著升高,表明小鼠肺炎模型建立成功(图4)。

2.2.3 小鼠肠组织细胞因子的基因表达

与对照组相比,模型组小鼠肠组织中细胞因子GM-CSF、IL-2的相对表达量显著升高(P＜0.05、P＜0.01),表明小鼠肠炎模型建立成功,但IL-6和IL-33的表达量显著降低(图5)。

注:与对照组相比*P＜0.05, **P＜0.01。图4 各组小鼠肺组织细胞因子相对表达量Note.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Relative expression of lung cytokines in different mice of each group

注:与对照组相比, *P＜0.05, **P＜0.01。图5 各组小鼠小肠组织细胞因子相对表达量Note.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 5 Relative expression of intestine cytokines in different mice of each group

注:A:肺组织;B:小肠组织。图3 各组小鼠组织病理形态观察Note.A, Lung tissue.B, Intestine tissue.Figure 3 Histopathological changes of different mice tissues in each groups

3 讨论

造模过程中,我们通过小鼠肺和小肠组织的炎症损伤及DAI指数来评估小鼠胃肠型流感的严重程度。为了评估该模型是否建立成功,在本研究中,肺指数、肺部病毒载量以及肺组织中炎症因子被用作肺炎模型的评价指标。DAI评分、小肠组织病理损伤及肠道炎症因子的表达量被用作肠炎模型的评价指标。与对照组相比,若感染H1N1小鼠肺指数、肺部病毒载量以及肺和小肠中炎症因子升高,DAI指数升高,且出现明显的组织病理损伤,表明小鼠肺炎-肠炎模型成功建立。

造模过程中,模型组小鼠的体重呈现持续性下降趋势,且小鼠出现精神萎靡、呼吸急促等现象,感染病毒后7 d,1 TCID50和10 TCID50组小鼠体重明显低于对照组,但肛温变化不明显;小鼠肺、胸腺等脏器指数出现显著性差异,但是脾指数变化不明显;孙启慧[8]以肺指数及H1N1基因相对表达量为指标成功建立流感模型,小鼠感染流感模型后,肺指数变大,肺组织H1N1基因相对表达量显著升高(P＜0.01),因此肺部病毒载量及肺指数可以作为评估流感模型的一个重要指标。与对照组相比,1 TCID50和10 TCID50组小鼠肠组织变细、变短,肠道细胞因子ROR-γt显著升高(P＜0.05),而ROR-γt作为Th17细胞等淋巴细胞的转录因子,当其表达升高时会诱导Th17细胞过度分泌IL-17、IL-22、GMCSF等炎症因子,致使肠道免疫失调,造成炎症损伤[9],因此选定ROR-γt的基因相对表达量为流感所致肠道炎症损伤的指标。

各检测数据显示,小鼠滴鼻感染10 TCID50、1 TCID50浓度病毒后,造模结果较理想,但是,10 TCID50组小鼠死亡率过高,不利于实验取材,且1 TCID50组小鼠ROR-γt基因相对表达量更高,综合流感模型小鼠死亡率及肠道细胞因子表达情况确定感染剂量为1 TCID50。

对1 TCID50病毒感染剂量进行验证,病理切片显示模型组小鼠肺组织见坏死细胞及大量渗出物,周围肺组织结构不清晰,炎性细胞浸润,肺泡壁增厚。RT-PCR结果显示,肺部炎症因子IL-2、IL-6、IFN-γ及IL-17A显著升高。IL-17是T细胞诱导炎症反应的早期启动因子,可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应,IL-17与受体结合后,导致NF-κB靶基因及MAPK的激活,与IFN-γ产生协同作用,激活C/EPB,动员、募集及活化中性粒细胞,从而介导肺部组织炎症[10-11]。

小肠病理切片显示,模型组小鼠出现绒毛萎缩断裂,淋巴细胞浸润等病变,肠道炎症因子GM-CSF和IL-2显著升高,IL-6与IL-33显著降低。IL-6是一种多效性细胞因子,在不同的组织及微环境中显示出不同的作用,在炎症方面,既具有促进炎症的功能,也具有抵抗炎症的作用。当H1N1病毒通过呼吸道传播进入肺组织后,刺激宿主调动巨噬细胞活化免疫系统,使IL-6分泌增加,IL-6可通过募集单核细胞至抗原感染部位,诱导炎症细胞黏附、聚集,抑制Treg细胞分化及抑制T细胞凋亡,导致肺血管的通透性増加,引起肺间质水肿,发挥促炎作用。在肠道组织中,IL-6可通过信号转导,激活转录激活因子3(STAT3),促进上皮细胞增殖,抑制其凋亡,从而达到抗炎效果。Cao等[12]研究发现与正常小鼠相比,IL-6-/-小鼠促进了葡聚糖磷酸钠盐诱导的结肠炎的发生。Ye等[13]发现,与IL-10缺陷小鼠相比,IL-6与IL-10双重缺陷的小鼠可通过抑制Treg/CTLA-4、促进IL-1β/Th2通路显著加重了肠道炎症,展现出更早的疾病发作,且会诱导全身炎症。同时,也有一些肠炎模型中,IL-6表现出升高的趋势[14-16]。因此,IL-6在肠道炎症中的作用存在较大争议,是我们今后研究的重点。

与IL-6类似,IL-33参与多种自身免疫性疾病的发生和进展,但其在不同自身免疫性疾病中的作用和机制不尽相同(甚至各异),提示其作用的多样性。例如:通过诱导Th2免疫应答而缓解Th1/Th17介导的EAE[17];通过作用于肥大细胞,可促进Th1/Th17免疫应答来参与类风湿关节炎发生[18]。段利华等[19]的研究发现,体外给予小鼠IL-33可缓解TNBS诱导的肠炎,其机制可能与上调Treg相关。因此,与正常对照组相比,本研究模型组小鼠肠组织中IL-33显著性降低是正常情况,但其具体机制有待于进一步研究。

综上所述,甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎-肠炎模型造模成功,最佳感染剂量为1 TCID50,该造模方法稳定、可靠,胃肠型流感的病理基础及抗病毒药物研究提供工具和手段。