miR-488-3p靶向调控RAP1A在同型半胱氨酸介导肝细胞自噬的作用研究

高 源揭育祯马天龙汪乐新杨慧霞周瑜瑾焦 运卢冠军马胜超*

(1.宁夏医科大学临床医学院,银川 750004;2.宁夏医科大学基础医学院,银川 750004;3.国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室(宁夏医科大学),银川 750004;4.宁夏医科大学总医院,银川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种由体内甲硫氨酸代谢循环产生的非蛋白原性含巯基氨基酸,为半胱氨酸的同系物。Hcy的浓度受两个关键途径的调节:再甲基化回蛋氨酸或转硫成半胱氨酸,同时产生硫化氢(H2S)[1]。研究数据表明,高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)被认为是动脉粥样硬化血栓形成和肝疾病发展的独立危险因素[2-3]。自噬是细胞将自身损伤的蛋白质或细胞器降解加以循环利用的过程,在细胞新陈代谢和内环境稳态调节中发挥重要作用。目前自噬在肝疾病发展的作用机制尚不明确[4]。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为20～22 nt的高度保守的非编码RNA,研究已证实miRNAs作为自噬活性的新型有效调节剂,可以通过与靶mRNAs的碱基对结合在转录后调控生物学过程和细胞信号通路,在功能上参与了肝细胞中细胞应激、炎症和纤维化的激活[5]。其中,miR-488-3p已被证实在多种癌症中是一种肿瘤抑制因子,但miR-488-3p在肝细胞损伤中的具体作用机制尚不清楚。生物信息学分析结果显示RAS癌基因家族成员RAP1A(Ras-associated protein 1,RAP1A)可能是miR-488-3p的靶基因。研究表明,在外界各种因子刺激下,RAP1A可与细胞膜上的受体结合,对细胞增殖、自噬和分化等多种生物学过程进行调控,已成为疾病防治的新靶标[6]。本研究以正常人源肝细胞(HL-7702)为研究对象,给予100 μmol/L Hcy干预24 h,探讨miR-488-3p在Hcy诱导的肝细胞自噬中的关键作用及其可能的分子机制,分析了miR-488-3p与RAP1A在肝细胞中的表达情况,探究二者之间的靶向关系,为后续肝损伤的靶向治疗和预防提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞

正常人源肝细胞(HL-7702),购自上海名劲生物科技技术有限公司ATCC细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

Hcy购自Sigma公司;胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)、RPMI 1640培养基购自Gibco公司;青霉素-链霉素双抗和胰蛋白酶购自北京碧云天生物技术公司;LipofectamineTM2000转染试剂(货号11668019)购自ThermoFisher公司;总RNA提取试剂盒(货号DP419)购自天根生化科技(北京)有限公司;全蛋白提取试剂盒(货号KGP2100)购自江苏凯基生物技术股份有限公司;反转录和荧光定量PCR试剂盒(货号D7168)购自日本TaKaRa公司;兔抗LC3(货号ab192890)单克隆抗体和兔抗p62(货号ab109012)单克隆抗体购自美国Abcam公司;鼠抗RAP1A(货号ab175329)抗体购自美国Abcam公司;HRP标记的山羊抗兔二抗(货号ZB-2306)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;miR-488-3p引物由广州锐博生物科技有限公司合成;miR-488-3p抑制物和模拟物(miR-488-3p inhibitor和mimics)、miR-488-3p阴性对照(miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司。荧光定量PCR仪购自德国Analytik Jena AG公司;超净工作台(SJ-CJ-1FD)购自中国苏州安泰技术有限公司;5415D型微量台式离心机购自德国Eppendorf公司;Bio-Rad凝胶成像系统显影(货号MG8600)购自Thmorgan公司;酶标仪购自美国Bio-TEK公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

采用含有10%胎牛血清、1%双抗的RPMI 1640培养基于37℃、含5% CO2的细胞培养箱中常规培养正常人源肝细胞(HL-7702),每2 d换液1次,当细胞密度达90%,即可用胰蛋白酶消化进行细胞传代,继续培养。取对数生长期HL-7702细胞,待细胞生长至70%融合度时将培养基更换为含胎牛血清7%,分别用终浓度为0 μmol/L Hcy和100 μmol/L Hcy干预,其中0 μmol/L Hcy为对照组(Control),100 μmol/L Hcy为同型半胱氨酸组(Hcy),处理肝细胞24 h后,收集细胞进行后续实验。

1.3.2 细胞转染及分组

利用LipofectamineTM2000将NC-inhibitor、NCmimics、miR-488-3p inhibitor和miR-488-3p mimics转染至肝细胞,选择生长状态良好的肝细胞进行培养。按照每孔2×105个细胞数接种于6孔板,待肝细胞生长密度达到70%时,用无RNA酶枪头对细胞进行转染,在125 μL无血清培养液中加5 μL LipofectamineTM2000此为A液,室温下孵育5 min;再在125 μL无血清培养液中加入2.5 μL待转染序列此为B液;将A液与B液混合,轻轻震荡混匀后孵育20 min。弃去旧培养基用PBS清洗后再将A、B混合液加入到培养板中,并每孔补加培养液至1 mL,6 h后换成7% FBS的培养基,并加入100 μmol/L Hcy干预,继续培养24 h后收集细胞进行后续实验,每组设3个复孔。

实验分组:肝细胞转染NC-inhibitor和NCmimics分别作为miR-488-3p干扰对照组和过表达对照组,同型半胱氨酸+干扰对照组(Hcy+NCinhibitor),同型半胱氨酸+miR-488-3p干扰组(Hcy+miR-488-3p inhibitor),同型半胱氨酸+过表达对照组(Hcy+NC-mimics),同型半胱氨酸+miR-488-3p过表达组(Hcy+miR-488-3p mimics),同时设miR-NC为miR-488-3p阴性对照组。

1.3.3 Western blot检测肝细胞中LC3、p62蛋白的表达水平

收集实验各组肝细胞,根据全蛋白提取试剂盒说明书于冰上提取全细胞蛋白,将裂解的细胞样品转移至1.5 mL离心管中,5000 r/min离心5 min,取上清;用BCA法测定蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液(5×)于金属浴中99℃煮沸5 min使蛋白变性,上样进行SDS-PAGE凝胶电泳后0.3 A恒流电转2 h将蛋白转至PVDF膜,接着5%脱脂牛奶室温封闭4 h,PBST洗涤3次后分别加入1∶1000稀释比例配制的LC3、p62和RAP1A特异性一抗,4℃摇床孵育过夜,PBST洗膜3次,每次10 min,使用稀释比例1∶5000的辣根过氧化物酶标记的二抗,室温置于摇床上孵育2 h,PBST洗膜3次;最后加入显影剂在Bio-Rad凝胶成像分析仪上成像分析,以β-actin为内参,采用Image J软件进行分析LC3II/β-actin、p62/β-actin及RAP1A/β-actin的灰度值,计算目的蛋白相对表达水平。

1.3.4 qRT-PCR检 测miR-488-3p和RAP1A mRNA的表达

根据总RNA提取试剂盒说明书,采用TRIzol法提取各组肝细胞总RNA;以miR-488-3p特异性逆转录试剂盒和PCR引物进行逆转录及qRT-PCR检测miR-488-3p的表达,miR-488-3p引物由广州锐博生物科技有限公司合成;运用GeneBank数据库查询RAP1A基因序列并设计引物。RAP1A:上游引物:5’-ACGGGTTAAAGACACAGAAGATGTTCC-3’;下游 引 物5’-CTGTCTTGCTAAATTCTGGCCTTGTTC-3’;U6上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATAT ACT-3’,下游引物:5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT GTC-3’;GAPDH上游引物:5’-ATTCCACCCATGGC AAATTCC-3’,下游引物:5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’。PCR反应体系为:TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 10 μL,10 μmol/L上游引物和下游引物各0.8 μL,ddH2O 6.4 μL,cDNA模板2 μL。其中总的反应体系为20 μL。PCR扩增的程序为:95℃ 10 min,95℃ 5 s,60℃ 20 s,70℃ 10 s,共45个循环,设置空白对照和内参(miR-488-3p内参为U6;RAP1A内参为GAPDH)对照同体系扩增。根据扩增曲线数据,按照计算公式2-ΔΔCt分析miR-488-3p和RAP1A的含量并进行归一化。公式如下:2-ΔΔCt=[Ct (Sample) (待测样本) - Ct (内参) (待测样本) ]- [Ct (GI) (校正样本) Ct (内参) (校正样本) ],实验重复3次。

1.3.5 miR-488-3p靶基因的预测分析

运用在线生物信息学软件StarBase v3.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析预测miR-488-3p与RAP1A的结合位点。

1.4 统计学方法

上述实验结果均为计量资料,采用Graphpad Prism 8.0 统计软件对实验数据进行统计分析,符合正态分布的计量资料采用平均数±标准差(±s)表示,两样本均数间结果的比较采取Student’st检验,多个样本之间比较采用One-way ANOVA检验,再进行组内两两比较。两变量之间相关性分析采用Pearson相关系数,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hcy对肝细胞自噬水平的影响

为验证细胞自噬在Hcy致肝损伤过程中的变化,Western blot检测肝细胞中自噬相关蛋白LC3与p62的表达水平,结果显示,与Control组相比,Hcy组中自噬相关基因LC3蛋白表达显著升高(P＜0.01),p62蛋白表达明显降低(P＜0.01),见图1。

2.2 Hcy对miR-488-3p表达的影响

qRT-PCR检测肝细胞中miR-488-3p的表达,结果显示,与Control组相比,Hcy组中miR-488-3p的表达升高(P＜0.01),见图2。

2.3 干扰和过表达miR-488-3p在肝细胞中对自身表达的影响

为了明确miR-488-3p在Hcy诱导肝细胞自噬中的作用,肝细胞分别转染miR-488-3p干扰(miR-488-3p inhibitor)和miR-488-3p过表达(miR-488-3p mimics)。采用qRT-PCR检测miR-488-3p的表达,结果显示,与NC-inhibitor组相比,miR-488-3p inhibitor组中miR-488-3p的表达显著降低(P＜0.01);而与NC-mimics组相比,miR-488-3p mimics组中miR-488-3p的表达明显升高(P＜0.01);表明miR-488-3p干扰和过表达片段转染成功,并能在肝细胞中稳定的表达,见图3。

注:与对照组相比, **P＜0.01。图1 Hcy对肝细胞自噬水平的影响Note.Compared with Control group, **P＜0.01.Figure 1 Effect of Hcy on the level of hepatocyte autophagy

2.4 miR-488-3p对Hcy诱导的肝细胞自噬的影响

为了进一步探讨miR-488-3p对Hcy诱导的肝细胞自噬的作用,肝细胞转染miR-488-3p inhibitor及NC-inhibitor后,同时给予100 μmol/L Hcy干预24 h,采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达,结果显示,与miR-NC组相比,miR-488-3p inhibitor组中LC3的蛋白表达水平显著降低,而p62的蛋白表达明显升高(P＜0.01);与Hcy+NCinhibitor组相比,Hcy+miR-488-3p inhibitor组的结果一致(P＜0.01),见图4A和4B。同时,将miR-488-3p mimics及NC-mimics转染肝细胞后,Western blot检测自噬相关蛋白LC3和p62表达的变化,结果显示,与miR-NC组相比,miR-488-3p mimics组中LC3的蛋白表达水平升高,而p62的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01);与Hcy+NC-mimics组相比,Hcy+miR-488-3p mimics组LC3的蛋白表达显著增加,而p62的蛋白表达降低(P＜0.01),见图4C和4D。

2.5 Hcy促进肝细胞中RAP1A的表达

为了阐明miR-488-3p的作用机制,通过生物信息学TargetScan在线软件(http://www.Targetscan.org/vert_72/)预测了miR-488-3p的潜在靶基因,结果发现RAP1A的3’UTR与miR-488-3p存在潜在结合关系(图5A)。首先采用100 μmol/L Hcy干预肝细胞24 h后,qRT-PCR及Western blot检测RAP1A mRNA和蛋白的表达水平。结果显示,与Control组相比,Hcy组肝细胞中RAP1A的表达显著升高(P＜0.01,P＜0.01),见图5B和5C。

2.6 miR-488-3p靶向调控肝细胞中RAP1A的表达

接下来进一步探讨miR-488-3p对RAP1A的靶向调控作用,将miR-488-3p inhibitor及NC-inhibitor转染肝细胞,Hcy(100 μmol/L)干预24 h后,采用Western blot检测干扰miR-488-3p后肝细胞中RAP1A蛋白的表达变化,结果显示,与miR-NC组相比,miR-488-3p inhibitor组中RAP1A蛋白的表达水平显著降低(P＜0.01);与Hcy+NC-inhibitor组相比,Hcy+miR-488-3p inhibitor组的结果一致(P＜0.01),见图6A。其次,为了进一步的验证miR-488-3p调控RAP1A介导肝细胞的自噬,将miR-488-3p mimics及NC-mimics转染肝细胞,同时给予Hcy干预24 h,Western blot检测过表达miR-488-3p后肝细胞中RAP1A蛋白表达的改变,结果与之相反,与miR-NC组或Hcy+NC-mimics组相比,miR-488-3p mimics组中RAP1A蛋白的表达水平明显升高(P＜0.01,P＜0.01),见图6B。

2.7 肝细胞中miR-488-3p的表达与LC3和p62蛋白表达的相关性分析

为了明确肝细胞中miR-488-3p的表达水平与细胞自噬之间的关系,利用Pearson相关系数对miR-488-3p的表达水平与自噬相关蛋白的表达水平分别进行了相关性分析。结果显示,miR-488-3p的表达水平与LC3(r=0.9329,P=0.0002)蛋白表达呈正相关,而与p62(r=-0.8086,P=0.0083)表达则呈负相关,见图7。

注:与对照组相比, **P＜0.01。图2 qRT-PCR检测Hcy干预肝细胞后miR-488-3p的表达Note.Compared with Control group, **P＜0.01.Figure 2 qRT-PCR to detect the expression of miR-488-3p after Hcy intervention in hepatocytes

注:1:对照组;2:干扰对照组;3:miR-488-3p干扰组;4:过表达对照组;5:miR-488-3p过表达组。与干扰对照组相比, **P＜0.01;与过表达对照组相比, ##P＜0.01。图3 转染miR-488-3p干扰和过表达片段后,qRT-PCR验证肝细胞中miR-488-3p的表达Note.1, Control group.2, NC-inhibitor group.3, miR-488-3p inhibitor group.4, NC-mimics group.5, miR-488-3p mimics group.Compared with NC-inhibitor group, **P＜0.01.Compared with NCmimics group, ##P＜0.01.Figure 3 After transfection of miR-488-3p interference and overexpression fragments, the expression of miR-488-3p in hepatocytes was verified by qRT-PCR

图7 肝细胞中miR-488-3p的表达与LC3和p62蛋白表达的相关性分析Figure 7 Correlation analysis between the expression of miR-488-3p in liver cells and the expression of LC3 and p62 proteins

注:1:阴性对照组;2:同型半胱氨酸+干扰对照组;3:miR-488-3p干扰组;4:同型半胱氨酸+miR-488-3p干扰组;5:同型半胱氨酸+过表达对照组;6:miR-488-3p过表达组;7:同型半胱氨酸+miR-488-3p过表达组。A、B:干扰miR-488-3p表达后,Western blot检测肝细胞自噬相关蛋白LC3和p62表达的改变;C、D:过表达miR-488-3p后,Western blot检测肝细胞自噬相关蛋白LC3和p62表达的变化。与阴性对照组相比, **P＜0.01;与同型半胱氨酸+干扰对照组相比, ##P＜0.01;与同型半胱氨酸+过表达对照组相比, &&P＜0.01。图4 干扰和过表达miR-488-3p后检测肝细胞自噬水平的变化Note.1, miR-NC group.2, Hcy+NC-inhibitor group.3, miR-488-3p inhibitor group.4, Hcy+miR-488-3p inhibitor group.5, Hcy+NC-mimics group.6, miR-488-3p mimics group.7, Hcy+miR-488-3p mimics group.A, B, After disturbing the expression of miR-488-3p, Western blot was used to detect the changes in the expression of autophagy-related proteins LC3 and p62 in hepatocytes.C, D, After overexpression of miR-488-3p, Western blot was used to detect the changes in the expression of autophagy-related proteins LC3 and p62 in hepatocytes.Compared with miR-NC group, **P＜0.01.Compared with Hcy+NC-inhibitor group, ##P＜0.01.Compared with Hcy+NC-mimics group, &&P＜0.01.Figure 4 Effect of interference and overexpression with miR-488-3p on the autophagy level of hepatocytes

3 讨论

同型半胱氨酸(Hcy)是一种非必需的含巯基氨基酸,为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的重要中间产物,主要发生在肝[7]。蛋氨酸代谢失调导致释放到血浆中的Hcy升高,进而引起肝损伤。自噬是一种进化上保守的过程,已成为一种关键的细胞内降解途径,它通过营养物质的循环利用和受损或老化的细胞质细胞器的降解来维持细胞功能和存活[8]。LC3是细胞自噬的经典标志物,其中LC3II为胞浆型,不具有自噬活性,而LC3I为膜型,是自噬激活的标志,当细胞发生自噬时LC3I向LC3II进行转化,是目前公认较成熟的自噬标志物[9-10];p62可作为将要被自噬作用降解的小泡的受体,也可作为要被清除的泛素化蛋白聚集物的受体。p62蛋白可结合泛素,也可与LC3结合,从而靶向自噬体并促进泛素化蛋白的清除[11]。自噬被认为是一把“双刃剑”,肝细胞的自噬功能障碍被认为是肝损伤的重要原因,并且已有观点提出细胞自噬来解释Hcy在肝损伤中的致病作用[12-13]。最近的研究表明miRNA和自噬在肝损伤的发生进展中都发挥着重要作用,miRNA靶向自噬相关基因并影响肝疾病的发生和发展[14]。课题组前期的研究中,我们在给予高蛋氨酸饮食的cbs+/-小鼠肝中观察到了自噬现象,电镜下明显有自噬小体的形成。在本研究中,我们通过体外给予100 μmol/L Hcy干预肝细胞24 h也发现了类似的结果,与正常对照组相比,Hcy组肝细胞中LC3蛋白表达水平明显升高,而p62蛋白表达下降;与之前的研究结果一致。以上提示Hcy可以促进细胞自噬进而诱导肝损伤[15]。然而Hcy在调节肝细胞自噬的潜在机制目前仍不清楚。

注:1:阴性对照组;2:同型半胱氨酸+干扰对照组;3:miR-488-3p干扰组;4:同型半胱氨酸+miR-488-3p干扰组;5:同型半胱氨酸+过表达对照组;6:miR-488-3p过表达组;7:同型半胱氨酸+miR-488-3p过表达组。A:干扰miR-488-3p后,Western blot检测RAP1A蛋白表达的变化;B:过表达miR-488-3p后,Western blot检测RAP1A蛋白表达的改变。与阴性对照组相比, **P＜0.01;与同型半胱氨酸+干扰对照组相比, ##P＜0.01;与同型半胱氨酸+过表达对照组相比, &&P＜0.01。图6 miR-488-3p靶向调控肝细胞中RAP1A蛋白的表达Note.1, miR-NC group.2, Hcy+NC-inhibitor group.3, miR-488-3p inhibitor group.4, Hcy+miR-488-3p inhibitor group.5, Hcy+NC-mimics group.6, miR-488-3p mimics group.7, Hcy+miR-488-3p mimics group.A, After interfering with miR-488-3p, Western blot was used to detect the changes of RAP1A protein expression in hepatocytes.B, After overexpression of miR-488-3p, Western blot was used to detect the changes of RAP1A protein expression in hepatocytes.Compared with miR-NC group, **P＜0.01.Compared with Hcy+NC-inhibitor group, ##P＜0.01.Compared with Hcy+NC-mimics group, &&P＜0.01.Figure 6 miR-488-3p targets and regulates the expression of RAP1A protein in hepatocytes

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为18～22 nt的小非编码RNA,可在转录后水平调节基因表达,主要作用于识别靶基因mRNA上3’UTR序列,定向碱基对结合后抑制mRNA的转录和翻译过程,从而调节靶蛋白的生成[16-17]。近年来多项研究发现miRNAs参与多种生物过程的调节,它们的缺失或表达改变与多种人类疾病(包括肝损伤)密切相关[18]。其中,miRNA122占肝表达的miRNA的一半以上,具有多种生理和病理功能,包括增强肝炎病毒复制、调节脂质代谢以及抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。成熟的miRNA可以通过被动释放或掺入脂蛋白复合物或微泡进入血流,并且在个体中具有稳定和可重复的浓度[19]。Long等[20]研究表明敲除miR-122可通过上调Sirt1有效减轻过度的脂质产生并抑制游离脂肪酸(FFA)处理的HepG2和Huh-7细胞中脂肪生成基因的表达。miR-488-3p作为一种新型的miRNA,位于1q25.2,由1个外显子组成。据报道,除了在骨关节炎患者的软骨组织中发挥保护作用外,miR-488-3p已被证实在食管鳞癌、胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤中发挥抑癌基因作用[21-22],此外,miR-488还可通过激活真核翻译起始因子3a(eukaryotic translation initiation factor 3a,EIF3a)介导的核苷酸剪切修复(nucleotide excision repair,NER)信号通路,抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,降低其顺铂敏感性[23]。然而,miR-488-3p的确切表达模式及其在Hcy诱导的肝细胞自噬中的作用背后的精确分子机制仍然很大程度上未知,需要进一步研究。

在本研究中,体外培养人的正常肝细胞,100 μmol/L Hcy干 预24 h后,发 现 肝 细 胞 中miR-488-3p和RAP1A的表达水平显著上调;为了明确miR-488-3p在Hcy诱导的肝细胞自噬中的作用,接下来将miR-488-3p inhibitor和mimis分别转染肝细胞后,采用Western blot分别检测肝细胞中LC3和p62蛋白表达的改变。结果显示,干扰miR-488-3p后LC3的表达含量显著减少,而p62蛋白表达减少;过表达miR-488-3p后可以明显促进Hcy诱导的肝细胞自噬的过程,提示miR-488-3p表达上调可促进Hcy介导的肝细胞自噬。这与Wei等[24]的研究结论一致。为了进一步探讨miR-488-3p对肝细胞自噬的潜在调控机制,利用生物信息网站Starbase v3.0软件在线预测发现miR-488-3p和RAP1A存在结合的互补碱基对。RAP1A是GTP酶Ras蛋白家族的成员,是分子量为21×103的小G蛋白,可调节细胞分化、生长并维持细胞存活[23]。本研究发现RAP1A是miR-488-3p的一个新靶点,接着对miR-488-3p过表达和沉默,同时Hcy处理肝细胞24 h后,发现miR-488-3p inhibitor组肝细胞中RAP1A蛋白表达水平明显降低,而miR-488-3p mimics组则结果相反,提示miR-488-3p正向调控了RAP1A基因的表达参与了Hcy介导的肝细胞自噬。另外运用Pearson相关系数对miR-488-3p转录水平与自噬相关蛋白的表达水平分别进行了相关性分析,结果呈正性相关。

综上所述,本研究发现在Hcy诱导的肝细胞中miR-488-3p表达上调,且miR-488-3p可以通过靶向正性调控RAP1A基因的表达,从而促进Hcy介导的肝细胞自噬水平升高,对肝损伤的研究有一定的意义。但如何将miR-488-3p的靶向作用应用到临床对肝疾病的治疗中还仍需要进一步研究。