流式微球捕获蛋白定量检测技术的原理与应用

徐晓雪 户乃丽 邹林樾 赵君朋

在液态生物样品，如血清、培养物上清、细胞裂解液中溶解有大量具有广泛生物学活性的蛋白质，在细胞或机体的生理活动和病理进程中发挥重要的作用，它们的浓度变化可以反映机体的免疫状态，评价实验和治疗的效果，预示疾病的转归，具有重要的科研和临床意义[1]。目前广泛采用的蛋白定量检测技术是酶联免疫吸附技术（enzymelinked immunosorbent assays，ELISA），通常需要准备大量的生物样品，1 次实验只能检测1 种目的蛋白，对样品中多种蛋白的检测需要成倍样品重复多次实验才能完成。传统的流式细胞术也可以检测细胞分泌的蛋白因子，但是由于流式检测信号必须由实体颗粒触发记录，因此检测局限于细胞及细胞附属物分析，无法直接检测悬液中溶解的成分，对细胞分泌蛋白的流式检测一般需要经过体外刺激培养细胞、阻滞细胞蛋白分泌、细胞表面染色、固定通透、胞内染色多步反应，样品处理复杂，干扰因素多，结果稳定性较差，无法定量。21 世纪初出现了专用于蛋白捕获的微球，通常为直径4～7.5 μm的聚苯乙烯微球，不同厂商有所区别，微球表面经过化学处理共价结合有特异性蛋白捕获抗体，可与目的蛋白形成免疫结合，捕获目的蛋白的微球如同一个表达特异蛋白的细胞，触发流式信号采集，通过流式荧光定量检测实现对溶解蛋白的定量检测，这就是流式微球捕获蛋白定量技术，它以微球代替细胞实现悬液中溶解蛋白的捕获检测[2]，增加流式定量检测可溶性蛋白的新应用。与传统蛋白检测技术相比，这一技术结合流式技术的优点，速度快、定量准确、高通量、可同时分析微球的多个参数，可以实现溶解蛋白的快速、准确、多重定量，在SARS、白血病等研究领域被多次使用，为疾病的研究和治疗提供新的工具[3]。本文主要介绍流式微球捕获蛋白定量检测的技术原理、特点、应用与局限性，帮助读者更好地理解和应用这一新技术。

1 检测原理

流式微球捕获蛋白定量技术也被称为悬浮点阵技术或液态芯片技术，是基于流式检测平台的液相、高通量、多重蛋白定量技术，是一项快速多重细胞因子定量检测技术。其技术原理是利用悬液中的微球表面固化样品中溶解的蛋白质，用各种带有差异固有荧光的微球分别包被特异性蛋白捕获抗体，使用时混合多种特异性捕获微球，制成微球悬液，形成液态捕获微球阵列，通过与待测样品溶液中的被测蛋白形成特异性抗原-抗体结合物，再与荧光检测抗体形成“三明治”夹心复合物。反应后的悬液样品经过流式细胞仪检测，识别不同捕获微球的固有荧光信号差异，在流式散点图上形成有序微球阵列，每种编码荧光微球对应一种目的蛋白，同时检测每种微球上结合的检测抗体荧光强度，由于检测抗体的荧光强度与待测蛋白的浓度正相关，使用待测目的蛋白的标准品，经过倍比稀释制备浓度已知的系列标准样品，检测1 组标准样品测得的荧光强度绘制标准曲线，将待测样品中测得的不同目的蛋白捕获微球的检测荧光强度代入各自的标准品曲线方程，可计算出反应样品中各种蛋白的浓度。因技术原理与固相中的酶联免疫吸附实验相似，因此也被称为悬液中的ELISA[1-2]。

2 技术特点及优势

流式微球捕获蛋白定量检测技术由4 个要素组成：微球、检测抗体试剂、流式检测仪器和数据分析软件。专用于蛋白捕获的微球是这一技术的关键，通常为直径4 ～7.5 μm 的聚苯乙烯微球，利用2 种或3 种光谱差异大的荧光染料按精确配比混合，分别染色微球，使其具有可精确区分的固有荧光，每种微球都共价偶联一种特异性捕获抗体，当不同微球混合在一起，可以在同一个反应体系中同时检测多种溶解蛋白。检测抗体偶联有荧光报告基团，通常为藻红蛋白，与被微球捕获的蛋白特异性反应，形成定量荧光信号，荧光强度与捕获蛋白的量正相关。微球的精确区分和蛋白的定量检测依赖流式检测技术，多数双激光、三激光流式细胞仪都可完成，也有专用检测仪器如Luminex 200、MAGPIX 等，原理与流式检测一致，微球编码荧光通常由红激光激发检测，检测抗体荧光通常由蓝色或黄绿色激光激发检测。检测数据的分析通常使用与试剂配套的专用软件，常见的通用流式数据分析软件，如Flowjo、Kaluza 等，也整合了用于分析微球捕获蛋白定量检测数据的分析模块。微球捕获蛋白检测具有和流式细胞检测类似的特点，样品制备反应在悬液中进行，抗原抗体混合均匀，接触充分，免疫结合特异性好，反应速度快；又由于完全采用荧光标识系统，信号存在光敏感性，全程需要避光；流式检测是对群体中大量颗粒的多重荧光定量，具有准确、快速、高通量、多参数的特点，1 次实验可以批量完成上百例样品的检测，检测样品体积低至25 ～50 μL，可同时检测1 个样品中的数十种蛋白。流式微球捕获蛋白定量检测具有和ELISA检测类似的特点，每个微球表面相当于ELISA 检测中的1 个微孔，具有固定的反应面积，结合有限量的反应物，因此检测样品浓度有上限，对于较浓的样品需要稀释检测；由于微球本身荧光本底与非特异性反应造成的本底在特异性荧光信号的识别中存在识别下限，检测下限通常为5 ～10 pg/mL，通常认为其检测灵敏度与ELISA 相当，高灵敏度的捕获微球则更为灵敏。由于流式检测微球数量巨大，远远超出ELISA 检测中的1 个微孔，数据是成百上千个微球的平均值，因此数据更稳定，具有结果稳定、可重复性好的特点[2]。见（图1）。

与ELISA 技术比较：流式微球捕获蛋白定量检测与经典的ELISA 检测比较有较为明显的优势[1-2]， 所需样本体积仅为常规ELISA 分析所必需样本量的1/6；完成1 次检测通常需要2 h，较ELISA 分析所需的4 ～5 h 缩短一半；反应中微球分散悬浮没有酶和底物背景的干扰；检测灵敏度通常为5 ～10 pg/mL，较ELISA 检测的通常灵敏度20 ～100 pg/mL 有所提高；可同时完成多种蛋白定量，常见的试剂盒一次可以完成6 个、7 个、13 个、24 个、36 个因子的检测，并且可根据实验需要自行组合被检测蛋白，数目可不固定；检测动态范围一般为500 倍浓度，大大超过ELISA 检测60 倍浓度的动态范围，可以减少对样品的稀释，更适合多种不同浓度、不同反应特征的待测物的同时分析；1 个样品1 次实验可获得多次ELISA 检测的结果，节省大量时间，费用也相应降低；对于有感染风险的样品，由于检测样品总量的下降，反应步骤的简化，检测时间的大幅缩短，可以大幅减少感染性飞沫和气溶胶的产生，生物安全性更高；分析微球数量巨大，结果稳定性高、可重复性更好。

与流式原位蛋白检测技术比较：目前应用流式检测平台可以进行细胞内蛋白检测和流式微球捕获蛋白定量检测，胞内蛋白检测样品细胞通常需要经过培养刺激蛋白分泌、表面标记、固定破膜、胞内标记与洗涤等多步，可以识别分泌蛋白的特异细胞群体，由于操作复杂，所需细胞数量巨大，操作时间长，干扰因素较多，且无法定量，主要应用于对特定细胞群体的功能状态分析，可重复性较差，临床较少使用；后者主要用于溶液样品中蛋白含量的检测，一般无法识别分泌蛋白的细胞来源，对于位于细胞内的蛋白成分需要制备细胞裂解液进行检测，但是所需样品量小，检测快速，检测通量大，同时检测多种蛋白，定量准确，灵敏度高，可重复性好，更适用于相对均一体系的蛋白检测和总体蛋白水平的监测，适用于科研和临床，这两种方法可根据检测目的选择或配合使用。

3 主要应用

流式微球捕获蛋白定量技术因其样品量小、灵敏度高、快速、可重复性好的优点，正逐渐成为基础研究与临床广泛应用的多重蛋白定量技术。应用此项技术已有多种商品化检测试剂产品，包括主要应用于通用流式仪器的BD CBA、AimPlex、Bender FlowCytomix 等检测产品，应用于Luminex 平台的Luminex、ProcartaPlex、Milliplex 等检测产品，应用于iQue Screener 平台的QBeads PlexScreen 检测产品等。理论上所有的荧光捕获微球检测都可以采用通用流式仪器和分析软件完成，但是根据仪器型号和性能不同，检测技术略有差异，不同公司的产品所覆盖的检测目的因子也有不同。目前可检测蛋白包括人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬和猪的可溶性细胞因子及多种可溶性蛋白靶标[4]。在科研中常用来对培养物上清、细胞裂解液、动物血清、体液、组织灌洗液样品中的免疫蛋白、炎症因子、趋化因子、生长因子细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白等蛋白靶标进行定量检测[5]。主要应用于感染疾病研究、肿瘤研究、干细胞研究、免疫学研究、疫苗研究、药物研发等领域。利用其微量高灵敏度的特点可以用来检测实验动物眼部房水样品中多种蛋白和牙髓腔内液体中多种炎症因子的含量，其快速高通量多重检测的特性适用于大规模的高通量药物筛选。在临床上，这种技术可用于患者机体炎症状态、免疫状态监测，识别炎症因子风暴的发生发展，监测自身免疫病患者病情，监测移植后患者免疫状态，监测肿瘤生物治疗后免疫状态、癌症筛查，在各种感染、非感染炎症、自身免疫病、过敏性疾病、内分泌与代谢性疾病以及肿瘤科、血液科、妇产科、儿科、精神科等临床研究中都有应用价值，特别是在儿科危重病患儿的诊断和治疗、急性公共传染性疾病的研究和临床诊治中具有特殊意义[6-9]。

4 技术局限性

与ELISA 技术类似，检测溶解的蛋白因子浓度，无法获得蛋白的来源细胞信息，得到的总浓度无法反映总体中各种细胞的反应差别；对多重蛋白同时检测，在被测蛋白浓度差异巨大时，可能需要以不同的稀释倍数重复检测；因为反应体系中同时存在多种反应成分，无法完全避免成分间相互作用的发生，对于特殊情况的了解还需要长时间大样本量数据的积累[10]。多重蛋白检测时微球的编码依赖差异荧光的识别，如果不同目的蛋白的微球编码荧光相近或重合，可能造成误读，个别试剂盒出现过相邻编码蛋白无法区分的情况；由于检测试剂盒品牌不同、采样仪器灵敏度差异可能带来检测结果的差异，跨平台的数据无法直接比较；实验操作上的差异，如样本冻融次数、反应温度时间、抗凝剂的种类、内毒素污染、稀释液的配方、标准曲线的配置不同批次的血清等，都可能带来检测的误差，不同批次的检测由于实验条件的不完全齐同所得数据的可比性下降；作为一项新兴技术微球捕获蛋白定量检测的商品化试剂盒还在不断发展中，产品覆盖的目的蛋白数量较为局限，对于较不常用的检测蛋白可能需要用户自行包被捕获微球用于检测。

5 总结

流式微球捕获蛋白定量检测技术的出现打破了流式细胞仪只能检测细胞内或细胞表面附属标记的局限，利用微球表面捕获实现各种可溶性蛋白因子的定量检测，具有流式技术的准确、快速、定量、高通量的优点，可同时完成多种因子的定量检测，节省样品、时间和费用，溶液中抗原抗体反应更充分，实验微球数量巨大，结果是大量微球反应的平均值，测定结果稳定性高，可重复性好，生物安全风险小，尤其适合分析临床微量样品中多种蛋白的含量，使用中应注意其技术局限性。