行为学训练对大鼠内源性神经干细胞增殖分化及Wnt5a蛋白表达的影响

吕威力 邢雪松

(沈阳医学院 1病理学教研室，辽宁 沈阳 110034；2解剖学教研室)

研究发现成年动物脑内神经干细胞(NSCs) 的增殖分化促进脑缺血修复，通过分化的新生神经元替代受损的神经元，在一定程度上能够改善神经功能缺损〔1～4〕。 Wnt5a信号通路在促进细胞增殖分化等过程中起着十分关键的作用,参与调控细胞内多种信号途径〔5〕。本研究建立大鼠血管性痴呆(VD)模型探讨VD相关信号分子Wnt5a与内源性NSCs的改变及行为学训练的影响，初步阐明VD中内源性VD增殖分化的机制。

1 材料和方法

1.1VD模型的制备 选用健康雄性2月龄wistar大鼠54只，体重220～240 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号〔SCXK(辽)2015-0001〕。随机分为：假手术组(Sham组，3、7、14、21 d，n=6)，模型组(Model组，3、7、14、21 d,n=24)，训练组(Training组，3、7、14、21 d,n=24)。采用两血管阻断加硝普钠降压法建立VD动物模型。术前4 h禁水，12 h禁食。手术台上仰卧位固定大鼠，1%(45 mg/kg)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，常规消毒后进行颈正中切口，分离两侧颈总动脉(CCA)，双侧迷走神经用玻璃针分离，注意避免牵拉，在夹闭双侧颈总动脉之前，腹腔注射2.5 mg/kg硝普钠，然后动脉夹无创夹闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，再10 min夹闭，打开动脉夹缝合伤口，局部庆大霉素抗菌后放回笼中正常饲养。用多导生物记录仪在实验过程中统计大鼠血压，结果显示大鼠平均动脉压在103 mmHg左右，注射硝普钠后动脉压迅速下降到51 mmHg左右，2 min后动脉压会缓慢上升到69 mmHg，持续1 h左右。大鼠在实验过程中直肠温度保持在37℃左右，以防止温度降低对脑缺血损伤的修复作用。假手术组不注射硝普钠和阻断颈总动脉，其他处置与建模大鼠相同。造模1 d后训练组给予行为学训练，分别在3、7、14、21 d后处死取脑，然后进行苏木素-伊红(HE)染色。

1.2穿梭箱训练 条件刺激是声音，非条件刺激是电击。将大鼠先放在穿梭箱内进行暗适应5 min，然后进行声音刺激5秒，如果大鼠不穿梭到另一侧，就进行电击，电流强度为15 mA，使大鼠逃到另一侧不通电的箱底，然后电击停止。如果不逃到另一侧箱底就电击5 s。让大鼠休息30 s后进行下一轮训练。穿梭箱训练在造模后进行，每次进行20次声和电的刺激实验。

1.3行学评分 各组大鼠手术后进行模型筛选，大鼠造模是否成功主要通过神经行为学评分进行评定，神经行为学评分参照了Zea Longa等〔16〕5分制标准：没有神经功能缺损0分；前爪不能完全伸展1分；大鼠行走的时候向两侧晃动2分；大鼠行走时身体向两侧倾倒3分；不能自发行走意识丧失4分。评分后0分和4分大鼠要被剔除，补充确保每个亚组6只大鼠。

1.4Nestin免疫荧光染色 常规灌注各组大鼠，然后取脑，连续冠状冰冻切片，片厚约30 μm，进行免疫荧光检测。PBST 0.01 mol/L洗涤切片，30 min 37℃孵育。硼酸缓冲液0.1 mol/L浸泡，PBST 0.01 mol/L洗涤。加入血清A，15 min 37℃孵育，勿洗倾去。滴加稀释1∶2 000的羊抗Nestin一抗，4℃过夜。PBST 0.01 mol/L洗涤。滴加1∶100四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)-兔抗山羊二抗，避光30 min 37℃孵育。0.01 mol/L PBST洗涤，贴片避光阴干稀释甘油封片后进行荧光显微镜观察和拍片。选取每只大鼠切片中3张具有典型反应的切片，在海马齿状回区每张切片取3个视野进行计数，采用Image-Pro Plus5.0图像处理软件对结果进行图像分析处理进行Nestin阳性细胞计数。

1.5Wnt5a 的免疫组织化学检测 取各组缺血大鼠前囟-3.14～前囟-4.5 mm海马区，片厚3 mm左右，4%多聚甲醛固定液浸入24 h后，应用免疫组织化学染色检测Wnt5a在缺血海马的表达情况。37℃在切片上滴山羊血清30 min，分别4℃过夜滴加一抗兔抗鼠Wnt5a，37℃滴二抗60 min，37℃滴入ABC复合液60 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后二氨基联苯胺(DAB)显色15 min，蒸馏水冲洗后常规脱水，透明中性树胶封片。阴性对照片用0.01 mol/L PBS代替一抗。光镜下用Metamorph/Evolution MP5.0显微图像分析系统每张切片测5个相同单位面积的平均灰度值。

1.6统计学方法 采用SPSS10.0软件进行t检验和方差分析。

2 结 果

2.1行为学评分 Sham组大鼠神经功能评分均为(0.00±0.00)分，无缺损。Training组与Model组相比，行为学评分下降明显〔(2.21±0.31)分vs(3.01±0.27)分，P<0.05〕。

2.2穿梭箱测试结果 与Sham组相比，Model组AAR和PAR率都显著下降(P<0.05)。Training组的AAR和PAR率显著高于Model组(P<0.05)。见表1。

表1 各组穿梭箱测试结果比较

2.3HE染色评估组织学改变 Sham组海马神经元排列整齐，结构清晰，神经元数量密集；Model组细胞周围的间隙变宽，神经元肿胀变性，分布不均，3 d亚组变化明显；见图1。与Model组比较，Training组海马神经元肿胀明显减少，细胞形态明显改善，神经元数量较多。

图1 Model组和 Training组3 d HE染色(×400)

2.4Nestin免疫荧光染色检测 Sham组海马可见切片上少量的散在的Nestin阳性细胞,3 d、7 d、14 d、21 d间比较无统计学意义(P>0.05)。Model组3 d组,缺血海马Nestin免疫阳性细胞表达开始增多,表现为大小不一并且呈簇状分布;7 d组Nestin阳性细胞达峰值;21 d组缺血海马Nestin免疫阳性细胞数有所减少，但是持续表达;Training组与Model组比较,3 d、7 d、14 d和21 d缺血海马Nestin免疫阳性细胞都显著增多(P<0.05) 。见表2、图2。

图2 各组海马Nestin及Wnt5a阳性细胞(×400)

表2 各组Nestin阳性细胞数表达及Wnt5a表达比较

2.5Wnt5a免疫组织化学检测 脑组织切片中显示Wnt5a蛋白阳性细胞为细胞质内有黄色或棕褐色颗粒。Sham组Wnt5a在海马表达轻微。Model组7 d Wnt5a反应阳性产物比Sham组明显增多，随缺血再灌注时间的进一步延长逐渐减少，14 d组表达逐渐减少，直到21 d组(P<0.05)。Training组在缺血海马神经元胞质内可见棕黄色颗粒Wnt5a表达，较Model组各亚组阳性产物表达增加(P<0.05)。见表2。

3 讨 论

VD是由脑血管因素造成脑组织损害所引起的痴呆综合征，主要临床症状为记忆力减退、表情淡漠和人格改变。目前已经证实在成人海马齿状回的颗粒下区有一定数量内源性NSCs。在一定条件下缺血NSCs反应性增殖，迁移到受损部位并且分化为神经元和神经胶质细胞，最终对神经功能修复的过程具有一定的促进作用〔7～9〕。

VD 患者缺血脑组织发生的病理性变化明显，比如大量神经元凋亡，这些改变在缺血海马组织中同样可以观察到，并且可以逐渐延伸到海马周边结构。目前研究海马组织是VD患者缺血脑组织结构中最明显的易受损区。海马作为机体感觉和运动的整合区，同认知功能与中枢神经系统突触的可塑性相关，是学习记忆的神经生物学基础。同时海马投射部位和学习记忆中枢有着不小的重叠区域，这样就可以理解VD 和海马之间的紧密联系了〔10,11〕。

Wnts家族是富含半胱氨酸的分泌蛋白，可通过结合受体激活体内多种细胞内信号通路来调控多种生物功能，比如各种细胞的增殖分化、凋亡存活和迁移能力等。Wnt5a在胚胎期及出生后各种组织器官细胞功能的发育中发挥重要作用。Wnt5a可以促进胚胎发育过程中神经的生长，因此基因突变后可导致胚胎体轴发育不良导致死亡。Wnt5a信号途径对脊椎动物早期发育同样发挥着重要的作用，比如背腹排列方向，汇聚延伸及各器官的形成。异种移植模型表明，Wnt5a信号通路还可以通过激活促癌基因的异常表达包括基质金属蛋白酶和层黏连蛋白，能使祖细胞增殖活性增强，参与肿瘤细胞的侵袭和转移过程。现在证实Wnt5a确实可影响造血细胞的增殖分化，外周血单核细胞有Wnt5a及其受体Fz的表达可以促进其向树突细胞的转化。Wnt5a可以通过激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，损害胰岛素受体底物的活性，从而抑制胰岛素信号，致使产生胰岛素抵抗。越来越多的证据表明，Wnt5a不仅在胚胎发育、细胞分化、组织形成过程中起重要作用，Wnt5a及其信号转导通路有可能成为疾病诊断与治疗的分子靶点〔12～16〕。

本研究结果说明，穿梭箱训练促进缺血海马损伤修复中起到至关重要的作用，Wnt5a对神经干细胞增殖分化具有促进作用。