miR-133在急性冠脉综合征中表达水平及临床意义

张文静 孙璐 孙彬

(潍坊医学院附属益都中心医院，山东 潍坊 262500)

急性冠脉综合征(ACS)是一组由心肌严重缺血所导致的进展性临床综合征，多为冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发完全或不完全闭塞性血栓形成引起〔1〕。研究指出，内皮细胞功能的正常发挥及炎症反应的调节是ACS发生和进展过程中重要环节〔2〕。目前对于ACS的诊断主要依赖高分辨率影像学成像技术和循环血生化标志物的检测，但是存在费用昂贵，诊断准确率有限的问题〔3，4〕。因此，亟需更加准确的诊断和治疗方法来对ACS患者进行早期诊断并提供及时治疗。微小RNA(miRNAs)是一系列内源性无蛋白编码功能的小RNAs〔5〕。研究表明，miRNAs是ACS诊断和治疗的潜在靶点〔6，7〕。miRNAs通过调控血管内皮细胞功能及炎症反应两个关键环节，发挥改善ACS预后的作用〔8，9〕。虽然目前已经揭示了部分功能miRNAs〔10〕，但是miRNAs在ACS中发挥作用的分子机制尚不清晰，极大阻碍了ACS疾病治疗的发展和创新。本实验评估miR-133在ACS患者中的诊断价值，并探究其对血管内皮细胞增殖和迁移的调控作用。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集80例ACS患者(ACS组)及80例健康人为对照(对照组)。患者在潍坊市益都中心医院通过冠状动脉造影进行确诊。本研究不包括有肾病史、糖尿病史和严重左室收缩功能障碍的ACS患者。在行冠状动脉造影之前收集患者血清。血清经离心分离后保存于-80℃进行进一步分析。本研究经潍坊市益都中心医院医学伦理委员会审查批准，所有患者都签署书面的知情同意书。

1.2细胞培养和转染 HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS；PAN，Aidenbach，Germany)和含1%链霉素和青霉素的DMEM培养基中培养，温度37℃，5% CO2。待细胞长至对数生长期，按照说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)分别转染模拟物对照物(mimic NC)、miR-133模拟物(miR-133 mimic)、抑制剂对照物(inhibitor NC)、miR-133抑制剂(miR-133 inhibitor)。

1.3RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR) qRT-PCR检测血清miR-133水平。使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取总RNA，使用反转录试剂盒(TaKaRa，美国)进行反转录。以U6位内参，采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(购自美国Biosystems公司)对miR-133的表达水平进行检测。反应条件：95℃ 15 min；94℃ 15 s；55℃ 30 s；70℃ 34 s，共40个循环。反应结束后，使用2-ΔΔCt方法对miR-133的相对表达量进行计算。

1.4CCK-8法检测细胞增殖能力 将转染后处于对数生长期的细胞以每孔1 000个细胞的标准接种于96孔板中，连续培养3 d，每隔24 h进行检测，检测前向培养孔中添加10 μl CCK-8试剂，在培养箱中孵育2 h后，放置酶标仪上震荡10 min，检测490 nm处的吸光值，连续检测3 d，用来评估miR-133对细胞活力的影响。

1.5Transwell法检测细胞侵袭能力 稳定转染的细胞(5×104个/孔)悬液添加至Transwell的上室中，下室添加500 μl含10% FBS的培养基。放置培养箱中过夜培养，取出小室，用棉签将上室的细胞及基质胶擦拭掉，小室放在4%的多聚甲醛中固定10 min，加0.1%的结晶紫染色20 min，双蒸水清洗后，在显微镜下随机选取5个视野进行拍照并计数，检测细胞的迁移能力。

1.6统计学分析 采用SPSS19.0和GraphPad Prism5.0软件进行t检验、方差分析χ2检验。受试者工作特征(ROC)曲线评估血清miR-133在NPC患者中的诊断价值，计算曲线下面积 (AUC)。通过Pearson相关系数分析血清miR-133表达水平与临床各指标的相关性。

2 结 果

2.1研究群体临床病理特征 两组年龄、性别、吸烟史、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均无显著差异(P>0.05)。ACS组心脏型脂肪酸结合蛋白、血管性血友病因子、血清白细胞介素(IL)-6、血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、血清IL-1β水平均显著高于对照组(P<0.001)。见表1。

表1 两组临床病理特征比较

2.2两组血清miR-133的表达水平 miR-133在ACS组血清中的表达水平高于对照组(1.463±0.233 vs 1.006±0.283)，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.3miR-133在ACS中的诊断准确性 miR-133诊断ACS的AUC为0.892，灵敏度82.5%，特异度85.0%，临界值为1.275。见图1。

图1 miR-133在ACS中诊断准确性ROC曲线

2.4ACS患者中miR-133与内皮损伤和炎症的关系 ACS患者的血清miR-133的表达水平与心脏型脂肪酸结合蛋白(r=0.576)、血管性血友病因子(r=0.707)、血清IL-6(r=0.725)、血清TNF-α(r=0.654)、血清IL-1β的水平呈显著正相关(r=0.420，均P<0.001)。

2.5miR-133对VSMC细胞增殖和迁移的影响 VSMC细胞转染miR-133 mimic后，miR-133的表达水平显著升高，相反，转染miR-133 inhibitor显著抑制了miR-133的表达水平。miR-133高表达显著促进了VSMC细胞增殖和迁移能力，相反，miR-133低表达则显著抑制了VSMC细胞的增殖和迁移能力。见表2。

表2 miR-133对HUVEC细胞增殖和迁移能力的影响

3 讨 论

miRNAs在包括心脑血管疾病在内的多种人类疾病中起到关键作用〔11〕。循环miR-195-3p升高被证明是心力衰竭患者的诊断性生物标志物〔12〕。miR-487b能够通过IL-33/ST2信号通路减少心肌凋亡和炎症反应，从而改善慢性心力衰竭〔13〕。本研究结果发现miR-133在ACS中高表达。研究表明，miR-133在各种心血管疾病中发挥了重要的生物学功能。Navickas等〔14〕发现，血清miR-133在心血管疾病中显示出一定的诊断的潜力。过表达miR-133具有抑制内皮细胞增殖和迁移的作用〔15〕。

ACS是一种复杂的表型，受环境和遗传因素的影响，其病理过程包括内皮细胞功能障碍、炎症改变及血栓成分之间的相互作用〔16〕。ACS患者的冠状动脉疾病的病理进展非常迅速，早期诊断和预后治疗治疗ACS是至关重要的〔17〕。本研究相关性分析结果发现，ACS患者血清miR-133的表达水平与血管内皮损伤标志物的水平显著正相关。炎症和内皮功能障碍在ACS患者急性治疗和长期管理中也起重要作用。已有研究报道，miR-133通过调控机体的炎症反应，参与多种疾病的进展〔18，19〕。本研究结果说明miR-133可能通过调控机体的炎症反应，参与ACS的进程。

虽然在临床方法中已经有了一些进展，但ACS患者的预后仍然不佳〔20〕。研究表明，在ACS的发展过程中，血管内皮细胞(VECs)功能障碍是参与ACS发病机制的重要因素〔21〕。此外，已有miRNAs被证实参与HUVECs细胞的增殖和迁移进程的调控〔22〕。例如，Luo等〔2〕在小鼠中研究发现，miR-150通过调控内皮细胞的增殖和迁移参与ACS的进程。在本研究中，我们进一步验证了miR-133在血管内皮细胞功能障碍中的作用。通过调控miR-133在HUVECs细胞中的表达水平，我们发现，miR-133高表达显著促进了VSMC细胞的增殖和迁移能力，相反，miR-133低表达则显著抑制了VSMC细胞的增殖和迁移能力。综上所述，miR-133在ACS患者中高表达，是ACS早期诊断的一个潜在生物标志物，miR-133可能通过调控血管内皮细胞的增殖和迁移参与疾病的进程。