YM155对T24细胞生物学行为影响

肖建华 游艳 董自强

(三峡大学 1第一临床医学院泌尿外科 三峡大学泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003；2附属仁和医院)

膀胱癌发病率居泌尿系统恶性肿瘤的首位，其发生机制同其他肿瘤一样，是机体在各种致癌因素作用下，膀胱组织的个别细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其异常克隆性增生而形成的新生物。细胞凋亡是指生物体内细胞在特定内外源信号诱导下，死亡途径被激活，并在有关基因调控下发生的程序性死亡过程。生存素(Survivin)作为凋亡抑制蛋白家族(IAP)家族中的重要成员，能明显抑制Fas、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)、B细胞淋巴瘤相关X蛋白(Bax)及多种经典化疗药物、白细胞介素(IL)-3、肿瘤坏死因子(TNF)-α、X-射线等诱导的细胞凋亡〔1〕，选择性表达于膀胱癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、皮肤癌等常见恶性肿瘤，而在癌旁正常组织和成人分化组织并不表达，可能与肿瘤细胞获得的某种异常抗凋亡能力相关。Du等〔2〕在研究 shRNA沉默survivin基因对人膀胱移行细胞癌T24细胞生物学行为影响的过程中发现pshRNA-survivin 2组细胞侵袭力与运动能力均有明显下降，证明了Survivin抑制措施用于膀胱肿瘤治疗的有效性和可行性。

YM155具有强大的抗肿瘤活性，并能增加多种肿瘤细胞对紫杉酚、顺铂、依托泊甙等化疗药物和γ辐照、免疫疗法的敏感性〔3〕。本研究旨在探讨YM155对T24细胞体外增殖作用的影响。

1 材料和方法

1.1T24细胞准备 T24细胞购于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，CCTCC编号为：GDC078。细胞经培养、传代、冻存后进行实验，所有过程确保为无菌操作。

1.2试剂 YM155，美国Selleck生命科学，货号：S1130，规格：5 mg/瓶。

1.3方法

1.3.1细胞毒性实验 将对数生长期的T24细胞用胰酶消化，加入培养液配成细胞悬液后接种到96孔培养板(每孔约2×104个细胞)，放入培养箱中培养；待细胞贴壁后进行试验。每96孔培养板上的细胞加样分调零孔(等体积培养液)、阴性对照组、不同浓度(0、10、100、1 000 nmol/L)YM155药物组。

1.3.2噻唑蓝(MTT)法细胞增殖抑制实验 分别将不同浓度YM155(1、5、10、50、100、500、1 000 nmol/L)分别加入贴壁生长的T24细胞培养板中，每孔加入药液100 μl且每种药物的不同浓度分别设置4个复孔；调零孔加入等体积的培养液，分别处理24 h、48 h和72 h后吸出培养孔中的上清，加入先前配制的浓度为5%MTT溶液，培养4 h，吸弃MTT，再加入二甲基亚砜(DMSO，每孔150 μl)，震荡5～10 min，在酶联免疫检测仪上570 nm波长测吸光值(OD值)，将所有实验组培养孔的测值减去调零孔组平均值，然后将目标孔中同一浓度组的4孔取平均值，计算细胞增殖抑制率(IR)和存活率并进行统计分析：(实验组OD值/阴性对照组OD值)×100%=生存率，1-生存率=抑制率。

1.3.3流式细胞术 对数生长期状态良好的T 24细胞，胰酶消化后用培养液制成细胞悬液，调整细胞数为3.0×105个/ml，均匀接种于无菌6孔培养板中，每孔2 ml，待其贴壁后进行换液，分别加入提前配好不同浓度的YM155药液(0、10、100、1 000 nmol/L)，置入培养箱培养48 h后1 000 r/min离心5 min，弃去药液，再次胰酶消化，移液器吹打，转入不同的离心管，离心后弃上清液收集细胞，分别用冷的缓冲液洗涤后各加入1.25 ml膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC,0.5 mg/ml)，室温黑暗环境中孵育15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞后各加入10 ml碘化丙啶(PI)染料(0.3 mg/ml)并借助流式细胞仪(美国Accuri Cytometers公司，型号：accuri C6)进行观察，以上所有操作按试剂盒(Beijing 4A Biotech Co.，Ltd)说明书进行。

1.3.4RT-PCR法检测不同浓度YM155对T24细胞的抑制作用 将生长状态良好的细胞用胰酶消化并配成细胞悬液，均匀种植到①，②，③，④号培养瓶中；待其贴壁后进行换液，分别加入临用前配好不同浓度的YM155药液(0、10、100、1 000 nmol/L)，培养48 h后弃药液，用胰酶消化细胞，Trizol(赛默飞公司，上海，中国)提取总mRNA，并经核酸测定仪测定样品RNA含量和纯度，OD260/OD280值在1.8～2.0提示RNA纯度高。根据RT-PCR试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)说明书将RNA样品拍照并采用SIM BIO-1D EXPRESS凝胶成像分析软件进行灰度分析，以β-actin作为内参，将目的基因扩增条带的灰度值与内参β-actin扩增条带的灰度值比值作为目的基因mRNA的半定量指标。

1.3.5免疫印迹法检测不同浓度YM155对T24细胞的抑制作用 将生长状态良好的细胞用胰酶消化并配成细胞悬液，待其生长贴壁后加入提前配好不同浓度的YM155药液置入细胞培养箱培养48 h后按照BCA试剂盒提取蛋白，并测定蛋白浓度；进行免疫印迹试验。ECL法显色后扫描成像，分析相应的光密度值，用各目的蛋白条带和内参条带光密度值之比表示各蛋白表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1细胞形态改变 未经药物处理的细胞生长良好，呈多角形或梭形，贴壁生长，增长速度快，一般1∶3传代分瓶，2 d后可以长满，培养液清亮。用不同浓度的YM155处理后细胞生长受到不同程度的抑制，随着药物浓度的上升，其抑制程度不断增加，主要形态学改变为细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，可见凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。见图1。

2.2YM155抑制体外培养的人膀胱癌T24细胞生长 同批次的T24细胞经不同浓度的YM155处理24 h，48 h和72 h后呈现出不同的生长抑制状态。当YM155浓度<5 nmol/L时，其对T24细胞生长影响不明显，但当其浓度>5 nmol/L后则不同程度抑制细胞生长，最佳作用浓度为5～100 nmol/L，当药物浓度一定即5、10、50、100、500 nmol/L时，随着药物作用时间的延长，T24细胞的生存率逐渐下降，其差异有统计学意义(F=26.26，19.102，19.866，14.526，15.251，P<0.01)，当作用时间一定时，随着YM155药物浓度的不断增加，T24生存率也呈明显下降趋势(F=127.279，204.653，243.229，P<0.01)。见图2。

图2 不同浓度YM155作用T24细胞不同时间后对生存率的影响

2.3YM155诱导体外培养T24细胞凋亡 分别用0、10、100、1 000 nmol/L 4种浓度的YM155处理T24细胞24 h后用流式细胞术Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡情况，重复检测3次后0、10、100、1 000 nmol/L YM155处理后的细胞平均凋亡率分别为(3.56±0.44)%、(19.76±1.42)%、(32.18±4.72)%、(47.81±3.57)%。10 nmol/L，100 nmol/L，1 000 nmol/L组细胞凋亡率明显高于0 nmol/L组，且随着YM155药物浓度升高，T24细胞凋亡率逐渐升高(F=132.131，P<0.01)。见图3。可见随YM155药物浓度的不断升高，细胞凋亡比率逐渐上升。

图3 T24细胞经不同浓度YM155处理后的凋亡发生情况

2.4YM155可抑制T24细胞中Survivin mRNA水平的表达 随药物浓度升高，细胞内Survivin mRNA含量不断降低，与0 nmol/L组(0.84±0.02)相比，10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L药物处理组Survivin mRNA表达显著降低(0.60±0.01，0.39±0.01，0.01±0.00，P<0.05)；且不同浓度药物处理组间Survivin mRNA表达也有明显的差异(P<0.05)。见图4。

图4 T24细胞经不同浓度YM155处理后survivin mRNA水平

2.5YM155抑制T 24细胞中Survivin蛋白表达水平 与0 nmol/L组(Survivin蛋白表达为0.95±0.13、Cleaved Caspase-3表达为0.52±0.07)相比，10 nmol/L、100 nmol/L和1 000 nmol/L组Survivin蛋白水平均显著降低(0.75±0.11、0.78±0.09、0.74±0.12，F=88.450，P<0.01)，Cleaved Caspase-3蛋白水平则显著上升(0.70±0.09、0.69±0.08、0.78±0.11，F=94.870，P<0.01)；且不同浓度药物处理组间差异显著(P<0.05)。见图5。

图5 Western印迹检测各组Survivin、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平

3 讨 论

膀胱癌是泌尿外科最常见，严重影响患者生活质量甚至威胁患者生命的肿瘤之一，其发病率和死亡率在国内有明显的上升趋势〔4～7〕。目前膀胱癌的治疗多以手术为主，再辅以膀胱灌注化疗，但其复发率高，化疗副反应多，且术后多需行尿流改道，尿路感染发生率高，患者生活质量普遍较低，期待新型高效、低毒的抗肿瘤药物或药物联合方案诞生。

YM155作为新型凋亡抑制因子Survivin的靶向抑制剂表现出了尤为强大的抗瘤潜能：在体外细胞水平，研究发现其可抑制超过119种人类肿瘤细胞株，其中包括非霍奇金淋巴瘤、激素治疗不敏感前列腺癌、非小细胞肺癌、白血病和黑素瘤等预后不良的恶性肿瘤〔8〕。本研究结果表明，YM155单独作用可以显著抑制膀胱癌T24细胞的生长，最佳作用浓度范围为5～100 nmol/L，且该抑制作用在一定程度上呈现出浓度依赖性和时间依赖性，作用机制可能与YM155特异性抑制Survivin的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡发生相关。

此外，有研究表明，YM155同顺铂和喜树碱等化疗药物没有交叉耐药性，对肿瘤细胞株的作用不受p53基因状态限制〔8〕，在同顺铂、碳铂、伊马替尼、γ射线等抗瘤措施联合应用时可协同增加抗瘤活性〔9，10〕。在不同肿瘤动物模型试验研究水平，YM155作为抗肿瘤制剂的有效性和安全性均超过了紫杉醇、顺铂等传统化疗药物，其给药途径灵活方便，静脉注射、皮下注射、瘤内注射均可达到理想的抗瘤效果而无明显毒副作用出现〔11〕。动物肿瘤模型体内联合用药时YM155同样可以增强常用化疗药物及放疗的抗瘤性能，对H460细胞和Calu6细胞肿瘤模型放疗敏感性的增强系数分别达3.3和3.5〔10〕，且在接受YM155治疗的动物中并没有发现组织损伤或体重显著丢失等副作用〔12〕。临床研究发现，Ⅰ期临床试验证实4.8 mg/(m2·d)剂量水平的YM155对化疗耐药的非霍奇金淋巴瘤患者产生治疗作用；多耐药弥漫性大B细胞淋巴瘤在接受YM155治疗2个周期后开始出现反应，6个周期后所有症状和体征均转为阴性，达到完全反应状态，无病生存期达4年以上；多药化疗和肝细胞移植后复发的滤泡状大B细胞淋巴瘤患者接受YM155治疗8个周期后出现部分反应，无病生存期维持到2年以上〔13〕。Ⅱ期临床试验中37例肿瘤患者有2例(5.4%)呈现出部分治疗效果，14例(37.8%)达到病情稳定状态，病情控制率达43.2%，中位无进展期时间为1.7个月，中位生存时间为6.6个月，1年生存率为35.1%〔14〕，且严重的并发症罕见。

综上，作为新型凋亡抑制因子survivin的靶向抑制剂，YM155在纳摩尔浓度级方可抑制众多肿瘤细胞株生长，减轻荷瘤动物模型的肿瘤负担，改善多药耐药或复发晚期肿瘤患者的预后。另有药理学分析表明YM155能选择性高分布于肿瘤组织中而很少有系统毒性反应出现，其抗瘤活性呈时间依赖性，在施药途径上以持续静脉注射时活性最高〔12〕，这些数据均为其进入临床来改善肿瘤患者预后奠定了坚实的基础。