小鼠胚胎心动脉囊的发生发育

张洁+张涛+李海荣+杨艳萍+崔慧林+曹锡梅

【摘要】 目的：探讨小鼠胚胎动脉囊的发生发育及其与第二生心区的关系。方法：对胚龄9～13 d（ED9～13）小鼠头胸部切片做HE和免疫组织化学PAP法染色。结果：ED10，动脉囊出现于心流出道远端，管壁主要由胰岛素增强子结合蛋白-1（ISL1）阳性内皮和间充质细胞构成，可见第二生心区、原始咽腹侧壁内胚层的ISL1阳性细胞增生并迁移至动脉囊壁。ED11～12，心动脉端向尾端移位、心包腔向头端及背侧扩展及ISL1阳性细胞的添加使动脉囊大部降入心包腔。ED12～13，含有ISL1阳性细胞的主肺动脉隔与流出道嵴愈合，将心包内动脉囊分隔为升主动脉和肺动脉干；动脉囊壁ISL1阳性细胞分化为大动脉相邻及游离壁的平滑肌细胞。结论：小鼠胚胎动脉囊是第二生心区细胞添加在流出道远端形成的。动脉囊壁ISL1阳性细胞分化为流出道心肌和主肺动脉干的平滑肌。

【关键词】 胚胎； 动脉囊； 胰岛素增强子结合蛋白-1； 免疫组织化学； 小鼠

【Abstract】 Objective：To research the development of aortic sac in mouse embryo and its association with the second heart field.Method：Serial paraffin sections through head to thorax of mouse embryo，from embryonic day 9 to 13（ED9-13），were stained with HE or immunohistochemical PAP method.Result：ED10，the aortic sac appeared distal to the outflow tract.Its wall was mainly composed of islet-1（ISL1） positive endothelium and mesenchymal cells.At this period，ISL1 positive cells from the second heart field and ventral endoderm of the primitive pharynx were observed migrating into the aortic sac.During ED11-12，the arterial pole of the heart moving caudally，the pericardial cavity expanding rostral and dorsally and the addition of ISL1 positive cells to the aortic sac collaboratively caused most of the aortic sac descended into the pericardial cavity.During ED12-13，the aorticopulmonary septum containing ISL1 positive cells，from the dorsal wall of the aortic sac，fused with the distal ridges of the outflow tract， resulting in the aortic sac in the pericardial cavity being separated into the ascending aorta and the pulmonary trunk.During this period，ISL1 positive cells in the aortic sac wall gradually differentiated into the smooth muscle cells of the facing walls and lateral walls of the great arteries.Conclusion：In the mouse embryo，the aortic sac develops from the addition of the second heart field-derived cells to the outflow tract.ISL1 positive cells in its wall differentiate into myocardium of the outflow tract and smooth muscle of the aortic and pulmonary trunk.

【Key words】 Embryo； Aortic sac； Islet-1； Immunohistochemistry； Mouse

First-authors address：Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.009

胚胎心動脉极发生发育异常导致先天性心血管缺陷[1]。22q11.2缺失综合征患者80%有先天性主动脉弓畸形[2]，传统观点认为主动脉弓源自胚胎早期的动脉囊。动脉囊连接弓动脉和流出道，主要由间充质构成。胚胎心流出道是右心室远端延伸至心动脉端的心肌性管道，内衬内皮，与心肌间为心胶质。因成体无动脉囊，多数学者将成体心室的流出道对应于胚胎心流出道，多关注胚胎流出道的发生发育。亦有学者将动脉囊和流出道作为整体进行研究，但忽视对动脉囊的观察[3-4]。近来发现流出道是原始心管形成后第二生心区添加在心动脉端形成的[5-7]，随流出道近段逐渐心室化[8-9]，流出道远端心肌界逐渐向心包腔内退却，提示动脉囊的发生发育可能亦与咽部组织的添加有关。endprint

本研究用抗α-平滑肌肌动蛋白（SMA）抗体标记早期分化的心肌细胞和平滑肌细胞[10-11]，用抗ISL1抗体标记第二生心区细胞[12-13]，用抗心肌肌球蛋白重链（MHC）抗体标记心肌，对ED9～13小鼠头胸部的切片进行HE和免疫组织化学染色，观察了动脉囊的发生发育及转归。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本制作 购买山西医科大学实验动物中心足3月龄健康雌性中国昆明小鼠32只，体重23～32 g，在明暗相间条件下自由进食饮水饲喂（明：7 am～7 pm），动情期与同种3月龄健康雄性小鼠于7∶30 pm合笼，次晨分笼，发现阴栓者即为妊娠0.5 d。乙醚麻醉妊娠小鼠，剖腹收集ED9～13胚胎，ED9胚胎带子宫固定，其余胚龄胚胎从子宫内剥离出后固定。标本经甲醇：丙酮：水（2∶2∶1 v/v）混合固定液室温下固定24 h后梯度乙醇、正丁醇脱水透明，石蜡包埋。取不同胚龄胚胎5～7只，制作为8 μm厚连续石蜡切片，每4片取1片做HE染色以观察各胚胎的形态结构，选出头胸部的切片用于免疫组织化学PAP法染色。载玻片经多聚赖氨酸处理。

1.2 免疫组织化学PAP法染色 所选标本经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，3%H2O2、TENG-T

[10 mmol/L Tris，5 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），150 mmol/L NaCl，0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH=8.0]依次各处理30 min，以减低内源性过氧化物酶活性和非特异性背景染色。处理后的切片分别用小鼠抗心肌肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC，1∶1000，upstate）单克隆抗体、小鼠抗胰岛素增强子结合蛋白-1（islet-1，ISL1，1∶100，Developmental Studies Hybridoma Bank）单克隆抗体、小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，SMA，1∶800，IA4，Sigma）单克隆抗体室温下过夜孵育。孵育后的切片顺次滴加兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG、兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物各孵育2、2、1.5 h；DAB显色，蒸馏水终止，阳性结果呈棕黄色。常规脱水、透明、封片。抗体均用pH值7.4 1×PBS稀释。

2 结果

ED9，心管静脉端尚未融合，流出道的形成使心管向右成襻（图1A～1D）。心管心肌表达MHC（图1B）、SMA（图1C），但大部分不表达ISL1（图1D）。流出道外包心肌，内衬内皮，两者之间为丰富心胶质，心胶质内无细胞（图1B～1C）。其动脉端未见动脉囊，直接通入1st弓动脉（图1A）。原始咽外侧ISL1阳性细胞（图1D↑）经背侧心包添加至流出道壁并逐渐表达SMA（图1C↑）、MHC（图1B↑）。

ED10，鳃弓内间充质细胞增多，流出道远端出现由内皮和间充质细胞构成的动脉囊，管壁无心胶质（图2A～2D）。连续切片示动脉囊除尾端腹面外，大部分包埋于心包腔外咽部间充质内，通过弓动脉连于背主动脉（图2D）。动脉囊壁细胞多呈ISL1阳性，除鳃弓、体壁及心动脉端心包的ISL1阳性细胞（图2C）外，还可见原始咽腹侧壁内胚层的ISL1阳性细胞（图2C↑）增生并迁移至心包背侧壁及动脉囊壁，这些细胞于近流出道心肌处逐渐表达SMA（图2B↑）和MHC（图2A↑）。

ED11～12，鳃弓内、动脉囊壁间充质细胞增加（图3A～3D）。动脉囊背侧的喉气管沟（或憩室）上皮及其腹侧大部分间充质细胞呈ISL1阳性（图3C）。心动脉端向胚体尾端移位、心包腔向头端及背侧的扩展以及喉气管原基腹侧、心动脉端心包及体壁ISL1阳性细胞向动脉囊的添加使4th弓动脉尾侧的动脉囊移入心包腔内（图3A～3D）。ED12，4th、6th弓动脉间喉气管腹侧的ISL1阳性间充质向动脉囊内突起形成主肺动脉隔，表面覆有SMA阳性细胞，其腹面与流出道嵴远端愈合将动脉囊分隔为心包内升主动脉和肺动脉干的雏形（图3A～3D）。添加至升主动脉和肺动脉干的ISL1阳性细胞（图3C）仅逐渐表达SMA（图3B），不表达MHC（图3A）。

ED13，心包内升主动脉和肺动脉干明显增长，管壁增厚，SMA阳性细胞增多（图4A），未见MHC表达。心包背侧壁及气管腹侧的ISL1阳性细胞明显减少，仍可见向升主动脉及肺动脉干的添加（图4B↑）。

3 讨论

动脉囊是心动脉端一个独立的结构，有独特的组织学结构，主要由间充质细胞构成。本研究发现，ED9，心管尚在融合中，动脉端向右弯曲成襻。流出道远端直接通入1st弓动脉，两者之间无形态和组织学结构与流出道不同的动脉囊。流出道管壁由心肌、心内膜及不含细胞的心胶质构成。此时，原始咽背外侧ISL1阳性细胞向流出道远端迁移并逐渐表达心肌标志SMA和MHC，表明第二生心区细胞不断分化为心肌细胞至心动脉端使流出道增长。Hiruma等[14]报道妊娠8.5 d（GD8.5）晚期心管动脉端通过腹主动脉、动脉襻（两者相当于1st弓动脉）连于背主动脉，但未對动脉囊进行探讨。ED10，流出道远端与弓动脉间出现由内皮和间充质细胞构成的动脉囊，管壁无心胶质，除尾端腹面外，大部分包埋于心包外间充质中；可见鳃弓、体壁、动脉端心包及动脉囊背侧咽内胚层的ISL1阳性细胞增生并迁移动脉囊壁，提示继流出道形成后，第二生心区ISL1阳性细胞向心动脉端添加形成了动脉囊。同时这些细胞于动脉囊与流出道交界处逐渐表达SMA和MHC，表明动脉囊近端的细胞受心肌细胞的诱导不断分化为心肌细胞使流出道增长，动脉囊是第二生心区心肌前体细胞进入心流出道的通道。ED11～12，随着尾端鳃弓及弓动脉的形成，鳃弓、动脉端心包、体壁及气管腹面ISL1阳性第二生心区细胞在动脉囊壁不断添加，动脉囊向尾端延伸，心动脉端向胚体尾端移位、心包腔向头端及背侧的扩展使动脉囊逐渐向心包腔内移位。目前资料多报道胚胎心流出道源于第二生心区，并未指出动脉囊与其相同的胚胎学来源。endprint

Waldo等[15]报道鸡胚流出道远端尾侧心包反折处的第二生心区，表达迁移标志HNK1，于Stage16～19（S16～19）添加至流出道分化为心肌，于S22～24添加至动脉囊区分化为升主动脉和肺动脉干根部游离壁的平滑肌，其余大血管壁的平滑肌细胞来自神经嵴。第二生心区心肌前体细胞呈螺旋状添加至流出道的对侧壁，平滑肌前体细胞则垂直进入动脉囊壁。第二生心区来源的平滑肌细胞SMA的表达晚于神经嵴来源的平滑肌细胞。认为大血管根部第二生心区来源的心肌和平滑肌之间及第二生心区来源和神经嵴来源的平滑肌之间的“缝”是马凡综合征主动脉夹层的好发部位[11]。心神经嵴切除后，心肌前体细胞到达流出道远端心肌而未进入流出道，平滑肌前体细胞则正常添加至心动脉端[15]；神经嵴切除致添加至流出道远端心肌的第二生心区细胞减少，流出道变短，心襻形成异常，但均未观察对动脉囊形态及结构的影响[16]。本结果表明，ED9～11，第二生心区细胞添加至心动脉端分化为流出道心肌，ED12～13，第二生心区细胞添加至心动脉端形成大血管壁的平滑肌细胞。Jiang等[17]用Wntl-Cre转基因鼠发现主动脉和肺动脉干近段由神经嵴细胞和平滑肌细胞构成，并推断后者可能来自气管附近咽部组织。我们的結果表明，ED10～13，流出道可能诱导其背侧的咽腹侧上皮增生增厚，形成喉气管沟（喉气管憩室）上皮及其腹侧的ISL1阳性细胞群，这些细胞可能受远端流出道的吸引，逐渐添加在其远端参与形成动脉囊壁。在基因调控和局部微环境作用下，于ED10～11，动脉囊近流出道的ISL1阳性细胞分化为心肌，于ED12～13，动脉囊壁大部分ISL1阳性细胞分化为大血管壁的平滑肌。有文献报道ISL1阳性第二生心区细胞不仅形成大血管的游离壁，亦参与形成其相邻壁[12]。本研究结果表明，随着动脉囊被分隔为升主动脉和肺动脉干，主肺动脉隔内的ISL1阳性细胞形成大血管相邻壁的平滑肌细胞，其余动脉囊壁的ISL1阳性细胞形成游离壁的平滑肌细胞。本结果支持ISL1阳性第二生心区细胞是多潜能细胞，不仅可以分化为心肌、心内膜细胞，还可以分化为大血管壁的平滑肌细胞[11，13，18-20]，文献[21]报道部分心神经嵴细胞亦表达ISL1。

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（收稿日期：2017-01-16） （本文編辑：程旭然）endprint