USP39通过HMGA2调控胶质瘤细胞增殖和迁移的作用机制

李军 刘小江 管诚 管义祥 丁锦荣

(南通大学附属海安医院神经外科，江苏 海安 226600)

恶性胶质瘤是成人最常见的侵袭性和致死性原发性脑肿瘤〔1,2〕。尽管治疗取得了巨大进展，但恶性胶质瘤患者的中位生存期为14.5～16.6个月〔3〕。目前主要治疗方法是手术切除肿瘤为主，结合放疗和化疗，由于特征复杂，包括侵袭性生长和弥漫性侵袭，其治疗效果欠佳，易复发，预后较差。近年来，许多研究工作集中在疾病的分子基础上，目的是将这种更好的理解转化为可行的治疗方法〔4〕。

泛素特异性蛋白酶(USP)39是一个基于Dub结构域序列相似性分类的去蛋白家族成员。由于Dub结构域中没有保守的活性位点残基(半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸)，USP39完全丧失了去氢脱氮活性〔5〕。USP39在酵母中也被称为Sad1p，在人类中被称为65 kD SR相关蛋白，这两种蛋白都与成熟剪接体复合体的组装有关，表明在mRNA剪接中起作用〔6〕。以前的研究已经证明USP39参与了极光激酶B转录的剪接〔5〕。斑马鱼USP39突变诱导视网膜母细胞瘤mRNA剪接缺陷基因rb1〔7〕。据报道，USP39也是EGFR前mRNA剪接的关键调节因子〔8〕。目前，有研究报道USP39在胃癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症中异常表达，其促进肿瘤发生和发展的生物学过程，包括增殖迁移、转移和凋亡等〔9〕。USP39在胶质瘤中的表达和生物学作用尚未阐释清楚。高迁移率族蛋白(HMG)A2和蛋白或DNA发挥作用，继而参与转录调控发挥生物学功能〔10〕。在多种恶性肿瘤组织中表达失调，属于原癌基因，与肿瘤的恶性程度和分期预后具有相关性〔11,12〕。然而，USP39-HMAGA2在胶质瘤中的作用尚未明确。本研究通过检测胶质瘤组织中USP39的表达，分析其与临床病理因素之间的相关性，进一步研究其对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人胶质瘤细胞株LN18、U87MG、A172、U251、P3及神经胶质细胞系(HA)均购自中国科学院(上海)。USP39和HMGA2抗体购于美国cell signaling公司。Matrigel是美国BD公司。Tanswell小室购于美国康宁。Lipofectamine 2000是美国Invitrogen。

1.2患者临床资料分析 收集2018～2020年海安市人民医院胶质瘤组织及其癌旁正常组织各112例。统计分析所有患者的临床病理资料，检测USP39的表达水平，将112例患者分为USP39低表达组和USP39高表达组，分析两组年龄、性别、肿瘤直径、淋巴结转移情况、病理分期。本研究通过医院伦理委员会的同意。

1.3细胞培养 所有细胞在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培养。细胞保持在37℃，在含有5% CO2的细胞培养箱中。

1.4USP39干扰及细胞转染 针对USP39基因设计特异性siRNA。当细胞A172和P3细胞贴壁密度达到70%左右时，接种于6孔板中，待细胞密度达到75%左右时，采用Lipofectamine 200转染试剂盒进行转染，分别将NC、敲降USP39转染至细胞中。放入细胞培养箱继续培养，48 h后开始后续实验。

1.5CCK-8检测细胞增殖 细胞接种于96孔×5个培养皿中过夜。根据制造商说明，添加CCK-8溶液(Dojindo；日本熊本)以每24 h评估细胞活力。在微板阅读器(PerkinElmer；加利福尼亚州圣何塞，美国)中，在450 nm处测量样品。

1.6Transwell小室检测细胞迁移和侵袭 将细胞(2×104/孔)接种到transwell小室(孔径：8 μmol/L；康宁的上腔中Costar；Tewksbury，MA，USA)和含有30%FBS(600 μl)的培养基加入下室。培养箱在37℃下培养24～36 h，并固定细胞4%多聚甲醛，结晶紫染色(Solarbio；中国北京)。从每口井的5个随机场(×100)获得图像。所有实验一式3份。细胞侵袭实验在Transwell小室内加入Matrigel基质胶，其余实验方法与迁移实验相同。

1.7RT-PCR检测组织和细胞中mRNA表达水平 根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Takara；日本东京)进行细胞和组织RNA分离。分离的总RNA被量化，并使用逆转录试剂盒(Toyobo；大阪，日本)生成cDNA。mRNA水平用实时PCR定量。GAPDH作为内部控制。采用以下引物：GAPDH上游引物：5′-GCACGTCAAGCTGAAAC-3′；下游引物：5′-TGGTGAAGAGCCAGAGGA-3′；USP39上游引物：5′-TGACCTCATTCATGCCACATCGT-3′；下游引物：5′-TTGCCTGTCCCATGATGAAGC-3′；HMGA2上游引物：5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′；下游引物:5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′。

1.8Western印迹检测蛋白表达 细胞和组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解中溶解。离心取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白质裂解物(20 μg)行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在5%脱脂牛奶中封闭膜，并在4℃下用一级抗体孵育过夜，然后用二级抗体(ZSGB-BIO)孵育。使用化学发光试剂盒(Millipore；Billerica，MA，USA)观察膜上的蛋白质。并使用Image J软件(Bio-Rad)进行量化。所有实验重复3次。

1.9统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1USP39在胶质瘤组织和细胞中表达升高 qRT-PCR 检测结果表明，USP39在112例胶质瘤组织中mRNA表达水平高于癌旁正常组织 (3.73±0.89 vs 1.18±0.53,t=26.052,P<0.001)。在人脑胶质瘤细胞P3、U87MG、U251、A172和LN18中的mRNA表达水平显著高于HA细胞(P<0.05)。USP39在人脑胶质瘤细胞P3、U87MG、U251、A172和LN18中的蛋白表达水平显著高于HA细胞(P<0.05)。见表1、图1。

表1 USP39在HA、P3、U251、U87MG、LN18和A172中细胞中mRNA蛋白的表达水平

图1 USP39蛋白在胶质瘤细胞中的表达

2.2USP39表达与胶质瘤患者临床病理因素的相关性 USP39的表达与胶质瘤分级具有相关性(P<0.001)。见表2。

表2 USP39表达与胶质瘤患者的临床病理特征的相关性(n)

2.3敲降USP39抑制胶质瘤细胞增殖 为了进一步研究USP39在胶质瘤发生发展中的生物学功能，我们在A172(NC组1.01±0.12，sh-USP39 0.34±0.16)和P3(NC组1.09±0.15，sh-USP39 0.37±0.16)细胞中通过慢病毒短发夹(shRNA)敲降USP39的表达。如图2所示，转染效率通过RT-PCR和Western印迹验证转染效果成功。采用CCK-8检测分析细胞增殖曲线的变化，如表3所示，敲降USP39后显著抑制了A172和P3细胞的增殖能力。因此，敲降USP39抑制胶质瘤细胞增殖。

图2 敲降USP39后细胞中USP39蛋白的表达

表3 不同时间各组细胞活性分析(450 nm OD值)

2.4敲降USP39抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭 Transwell迁移实验结果表明，敲降USP39可以显著抑制A172和P3细胞的迁移、侵袭能力，与对照组相比，迁移、侵袭细胞数量显著减少(P<0.05)。见图3、表4。

表4 敲降USP39抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭变化个，n=3)

2.5USP39调控HMGA2的表达 敲降USP39可以显著抑制A172和P3细胞中HMGA2蛋白表达(0.32±0.07、0.29±0.08)，与对照组(0.97±0.09、1.03±0.07)相比差异显著(P<0.05)。见图4。

图4 敲降USP39后细胞HMGA2蛋白表达

3 讨 论

以往研究显示，USP39有助于癌症的进展，并预测各种肿瘤的不良预后〔13,14〕。同时有研究表明USP39在多种癌症中异常表达〔15,16〕。本研究发现USP39蛋白水平的升高与胶质瘤分级有关。

有研究发现USP39促进卵巢癌细胞增殖和迁移等生物学功能〔17～20〕。本研究结果证明敲降USP39后显著抑制了A172细胞的增殖和迁移能力；过表达USP39有效地促进了U251细胞的增殖和迁移能力。

HMGA2位于染色体12q13-15上，参与多种生物发育的生物学过程〔21〕。HMGA2在肿瘤的发生和发展中也起到重要作用〔22〕。USP39调控下游的HMGA2，通过3′剪接位点改变剪接。过表达USP39可以使HMGA2的截断型转录升高。本研究发现过表达USP39可以显著抑制HMGA2的蛋白表达。

综上，在人脑胶质瘤组织和细胞中USP39高表达，且能促进胶质瘤的恶性肿瘤特性。因此，USP39在人类胶质瘤发育过程中似乎具有致癌特性。本研究进一步证明USP39的致癌活性是由于其能够调控HMGA2。