干扰NSUN2通过调控细胞周期蛋白表达抑制黑素瘤细胞增殖

李国锦， 王金萍， 张 强， 见玉文， 王珊珊, 2), 4)，张 涛,3),4)， 王 令,4)*

(1)陕西理工大学 生物科学与工程学院 生物工程系，陕西 汉中 723001； 2)陕西理工大学 陕西资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；3)陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723001； 4)陕西理工大学陕西秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室(培育)，陕西 汉中 723001)

黑素瘤是一种高转移与高侵袭性的恶性肿瘤，常见于皮肤，少见于口腔、肠道或眼睛[1]。黑素瘤的主要特征是病情进展迅速，易侵袭其他组织器官，且在发病早期症状不明显，诊断率较低，一旦确诊多属晚期[2]。一项多机构的回顾性研究评估了抗pd-1抗体在肢端黑素瘤和粘膜黑素瘤患者中的临床疗效。肢端黑素瘤患者的客观缓解率和中位无进展生存期分别为32%和4.1个月，粘膜黑素瘤患者的客观缓解率为23%和3.9个月[3]。现有的临床治疗手段很难取得理想的治疗效果，且患者的预后较差，生存率也极低[4-5]。因此，进一步深入探索黑素瘤的发病机制并寻找新的分子靶点，会在一定程度上提高早期诊断与治疗，有效减少肿瘤的发生与发展，进而降低黑素瘤的死亡率。

5-甲基胞嘧啶(m5C)RNA甲基化修饰是RNA转录后的一种修饰，广泛存在于tRNA、rRNA和mRNA[6]。其甲基化修饰发生在胞嘧啶的第5位碳原子，修饰后的RNA序列未发生改变，但基因的表达发生了可遗传的改变。RNA的m5C甲基化由系列甲基化酶催化完成。其中，太阳结构域家族蛋白酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2, Nsun2)是mRNA发生m5C修饰的关键酶。mRNA的m5C修饰通过提高mRNA稳定性和出核运输，增强蛋白质翻译等方式参与了细胞增殖[7-9]、细胞分化[10]和细胞衰老[11]等过程，而且与人类肿瘤的发生和发展密切相关[12]。据统计，NSUN2在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌等恶性肿瘤中均表达上调，已成为部分肿瘤发生发展和预后的候选标记[13-14]。

NSUN2在黑素瘤的发生和发展中作用机制尚不明确。本研究以小鼠黑素瘤B16细胞为材料，利用慢病毒载体稳定高效干扰B16细胞的Nsun2基因；通过细胞增殖检测和转录物组测序技术分析干扰Nsun2对B16细胞增殖的影响和关键差异表达基因及其相关信号通路，为解析黑素瘤发生发展的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

小鼠黑素瘤B16细胞、小鼠黑素前体细胞(mouse melanin precursor cells，MMPCs)[15]、HEK293 T细胞购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；慢病毒干扰载体pLKO.1-TRC-Puro、包装辅助载体psPAX2、pMD2.G由本实验室保存。内切酶EcoRI、AgeI和T4DNA连接酶购自NEB公司；嘌呤霉素购自Invivogen公司；脂质体2000(Lipofectamine 2000)购自Invitrogen公司；EdU试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；细胞培养基RPMI1640、胎牛血清FBS购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；逆转录试剂盒和实时荧光定量检测试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara Bio)。NSUN2、CDK1和CDK2兔多克隆抗体、HRP标记的GAPDH鼠单克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司(Proteintech)，GADD45A兔多克隆抗体购自Abcam公司。

1. 2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠黑素瘤B16细胞和黑素前体细胞MMPCs置于含10%胎牛血清和1%青链霉素的1640培养基，5% CO2，37 ℃培养箱中培养。

1.2.2 干扰载体构建 参考NCBI 公布的小鼠Nsun2基因mRNA序列(GenBank：NM_145354.5)，设计2个靶点序列和1个无关序列，结合骨架载体pLKO.1-TRC-Puro特征，设计并合成含目标序列的寡聚核苷酸引物(Table 1)。引物对经过直接退火合成含黏性末端的靶序列片段，克隆至骨架载体的AgeI和EcoRI酶切位点之间，测序鉴定后获得干扰载体2个，无关序列对照载体1个。

Table 1 DNA oligo sequence

1.2.3 Nsun2干扰细胞株的建立 利用脂质体2000将干扰载体、辅助包装质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞，转染48 h和72 h分别收取病毒上清液，离心后分装，置于-80 ℃保存备用。用制备的病毒液感染B16细胞，加入Polybrene(2 μg/mL)增强感染效率。感染24 h后更换含2 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基，连续筛选2周，获得稳定转染的细胞株。实验组细胞命名为Nsun2-shRNA1和Nsun2-shRNA2，对照组细胞命名为shRNA-NC。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测Nsun2表达 利用RNAisoPlus法分别提取干扰组和对照组B16细胞总RNA，按照Prime Script(TaKaRa)反转录试剂盒，合成cDNA第一链。以cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR系统(StepOne Plus，Applied Biosystems)检测稳定转染细胞株的Nsun2表达水平。qPCR扩增体系如下：SYBR Premix ExTaq 10 μL，上下游各1.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4.8 μL，总体积20 μL。反应程序95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，15 s，40个循环。每个反应设置3个重复，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算目标基因mRNA相对表达量。

1.2.5 Western 印迹检测目标蛋白质 收集待测细胞，加入RIPA裂解液，细胞裂解液经处理后进行SDS-PAGE，再转移凝胶中的蛋白质至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭。以抗NSUN2、CDK1和CDK2兔多克隆抗体(Proteintech)，以及抗GADD45A兔多克隆抗体(Abcam)为一抗。加入检测目标蛋白质的一抗(1∶500稀释)和HRP标记的GAPDH鼠单克隆抗体(Proteintech，1∶1 000稀释)，37 ℃孵育2 h后清洗膜3次。检测目标蛋白质的膜与HRP标记的羊抗兔IgG二抗(Proteintech，1∶1 000稀释)室温孵育，2 h后清洗膜，加入显色液，化学曝光仪检查，记录结果。利用灰度分析软件，量化信号强度，以GAPDH为内参，分析目标蛋白质相对表达量。

1.2.6 EdU掺入实验检测细胞增殖 参考EdU试剂盒操作说明，待细胞密度为70% ～ 80%时，加入EdU工作液(工作浓度10 μmol/L)，培养2 h弃培养液。4%多聚甲醛室温固定15 min，洗涤3次，通透15 min，加入Click反应液避光孵育30 min，吸去Click反应液，于倒置荧光显微镜观察。随机选择10个非重叠视野，用ImageJ软件分析统计蓝色荧光和红色荧光细胞数量，以同一视野下红色荧光细胞数与蓝色荧光细胞数的比值计算EdU阳性细胞率。

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖 取100 μL 细胞悬液(约10 000个细胞)接种于96孔板。分别于接种后24 h，48 h和72 h向培养细胞中加入WST-8浴液，孵育2 h。再用酶标仪测定450 nm吸光度(A450)，每组5个重复。

1.2.8 细胞克隆形成实验 6孔板接种500个细胞/孔，置于37 ℃，5% CO2培养箱中连续培养2周。待细胞克隆生长到适当大小，弃培养基，PBS清洗2次，70%乙醇固定后加结晶紫处理15 min，弃染液，每孔加2 mL PBS洗涤3～5次，室温干燥。倒置显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。克隆形成率=(细胞克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.9 RNA-seq测序及差异表达基因的富集分析 收集6 cm培养皿中对数生长期的Nsun2干扰组和对照组B16细胞。PBS清洗，加入1 mL Trizol裂解3 min，细胞裂解液转移至1.5 mL离心管，液氮速冻后置于干冰，寄送北京华大基因有限公司。从细胞裂解液中提取RNA并建库，进行RNA-seq测序。其中，干扰组与对照组各设置3个重复。测序结果上传至华大基因多组学系统网站(https://biosys.bgi.com/)，进行在线分析。对测序数据总体质量分析合格的基础上，设置︱log2(fold change)︱≥1，Q-值≤0.05条件筛选差异显著基因，应用华大基因在线网站进行差异基因的GO和KEGG富集分析，寻找具有统计学意义的注释条目。

1.2.10 差异表达基因的验证 选取差异表达上调基因10个和下调的基因6个，以小鼠β-肌动蛋白作为内参基因，设计并合成定量PCR引物(Table 2)。参考1.2.4进行荧光实时定量PCR反应，2-ΔΔCt方法分析mRNA相对表达量。

Table 2 RT-PCR primers

1.2.11 统计学方法 采用SPSS 23软件对数据进行统计分析，用平均值±标准差表示统计分析结果，采用t检验比较各组数据统计学差异，差异显著(P<0.05)。

2 结果

2.1 NSUN2在B16细胞中蛋白质水平表达增高

为探究NSUN2在小鼠黑素瘤细胞中的表达水平，以黑素前体细胞MMPCs为对照组，应用Western 印迹检测NSUN2在2种细胞的表达水平。量化结果显示，NSUN2在B16细胞中表达量是MMPCs中的2.5倍(*P<0.05，Fig.1 A, B)，表明NSUN2在黑素瘤B16细胞水平表达显著高于正常黑素前体细胞。

Fig.1 The expression level of NSUN2 in two types of melanocytes (A) Western blotting detects the expression level of NSUN2 in two types of melanocytes. (B) Quantitative analysis of the expression level of NSUN2 in two types of melanocytes. Data are presented as mean ± SD (n=3). Two group comparisons were done with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to MMPCs

2.2 稳定敲低Nsun2和对照细胞株的建立

通过分子克隆方法构建靶向敲低小鼠Nsun2基因的shRNA载体和无关序列载体，包装重组慢病毒，再感染B16细胞，经嘌呤霉素筛选后获得病毒感染细胞株。以感染NC-shRNA的病毒细胞为对照，实时荧光定量PCR结果显示，shRNA1组和shRNA2组细胞中Nsun2表达水平分别降低了47.4%和59.6% (*P<0.05，Fig. 2A)。Western印迹检测结果显示，shRNA干扰后NSUN2蛋白质水平表达下调至28.6%和19.6%，说明成功敲低B16细胞的Nsun2基因表达(*P<0.05，Fig. 2B，C)。mRNA和蛋白质检测结果均表明，Nsun2-shRNA2组的干扰效果优于Nsun2-shRNA1组，故选择Nsun2-shRNA2干扰组为后续实验材料。

Fig.2 Detection of shRNA-mediated Nsun2 knock-down efficiency (A) qPCR detection of Nsun2 mRNA expression level. (B) Western blotting detection of NSUN2 protein expression level. (C) Quantitative analysis of NSUN2 protein expression. Data are presented as mean ± SD (n=3), two group comparisons were done with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to control

Fig. 3 Nsun2 Knockdown inhibits proliferation of B16 cells (A) Interference with Nsun2 and control group B16 cells EdU staining image. (B) EdU positive cell rate quantification diagram. (C) CCK-8 detection of cell proliferation. (D) Interference Nsun2 and control group B16 cell clone formation diagram. (E) Quantitative analysis of clone formation rate. Data are presented as mean ± SD (n=3). Two group comparisons were done with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to control

2.3 敲低Nsun2抑制B16细胞增殖

为探究敲低Nsun2表达对B16细胞增殖能力的影响，采用EdU染色法检测增殖期细胞数量，EdU阳性率越高说明细胞增殖能力越强。对照组细胞EdU阳性率为97.6%，敲低组细胞阳性率为40.5%(*P<0.05)(Fig. 3A,B)，说明稳定干扰Nsun2显著抑制B16细胞S期DNA合成能力。Nsun2基因敲低后，B16细胞在48 h和72 h的增殖能力显著低于对照组(Fig. 3C)。细胞克隆形成实验发现，稳定干扰Nsun2的B16细胞克隆形成率仅12.5%，显著低于对照组36.3%的克隆形成率(Fig. 3D,E)，说明稳定干扰Nsun2抑制B16细胞增殖和克隆形成能力。

2.4 RNA-seq测序数据质量分析

分别选择NC-shRNA对照组和Nsun2-shRNA实验组B16细胞进行RNA-Seq测序，每组3个生物学重复。各组的 Clean reads占比均大于98%，所有样品Q20均大于98%，Q30均大于94%(结果见Table 3)。综上所述，Nsun2敲低组和对照组细胞样品测序生成的数据均符合转录物组分析相关要求。

Table 3 Reads quality statistics after filtering

Fig.4 The statistical analysis of DEGs (A) Co-expressed genes and differential gene display between SiNsun2 and control. (B) The number of genes up-regulated and down-regulated in co-expressed genes. (C) Volcano map of DEGs with fold change ≥2. (D) The number of DEGs with fold change ≥2 . (E) Heat map of DEGs expression level in different samples

2.5 差异表达基因分析

通过比较敲低组和对照组细胞转录物组测序数据，两组共表达基因15 689个(Fig. 4A)。其中，2 080个基因上调，1 876个基因下调，11 733个基因无显著变化 (P<0.05，n=3)(Fig. 4B)。以︱log2(fold change)︱≥1，Q-值≤0.05为筛选条件，共筛选出1 062个差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，其中678个上调基因，384个下调基因(Fig. 4C, D)。通过聚类分析，进一步说明差异表达基因在组内样品间一致性较好(Fig. 4E)。由于NSUN2的主要功能是mRNA甲基化修饰，提高mRNA稳定性，增强翻译效率。干扰Nsun2后，其靶基因mRNA甲基化修饰减少；或调控靶基因的转录因子mRNA修饰下调，从而直接或间接影响DEGs表达。

Fig.5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes (A) Secondary GO terms enriched for differentially expressed genes. (B) Top 20 GO terms enriched for differentially expressed genes

2.6 差异表达基因GO功能注释分析

进一步对筛选的1 062个DEGs进行GO富集分析，生物过程(biological process)、分子功能(molecular function)和细胞组分(cellular component)分别富集了28、12和17个二级GO条目(Fig. 5A)。3个部分富集的前20个GO条目中，生物过程的前3个条目包括细胞周期(cell cycle)、细胞分裂(cell division)、DNA复制(DNA replication)；分子功能主要包括蛋白质结合(protein binding)、核苷酸结合(nucleotide binding)、微管结合(microtubule binding)等条目；细胞组分主要包括染色体着丝粒区(chromosome, centromeric region)、动粒(kinetochore)、浓缩染色体动粒(condensed chromosome kinetochore)等条目(Fig. 5B)。差异基因富集的GO条目说明，Nsun2主要通过细胞周期、大分子结合与染色体结构等方面调控黑素瘤细胞增殖。

2.7 差异表达基因KEGG 通路富集分析

对差异基因进行KEGG 通路富集分析。分别注释到细胞过程(Cellular Processes)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、人类疾病(Human Diseases)、环境信息处理(Environmental Information Processing)、新陈代谢(Metabolism)、有机系统(Organismal Systems)6个分支(Fig. 6A)。其中，差异基因在这3个一级通路中富集较多。在信号转导(signal transduction)、癌症(cancers)、免疫系统(immune system)、细胞生长和死亡(cell growth and death)等二级通路中富集的差异基因较多。

前20条显著富集的KEGG通路主要集中在细胞周期(cell cycle)、DNA复制(DNA replication)、ECM受体互作(ECM-receptor interaction)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、p53信号通路(p53 signaling pathwayp)、细胞衰老(cellular senescence)等(Fig. 6B)。其中，参与细胞周期的DEGs数目高达34个，与细胞衰老相关的DEGs 22个。敲低Nsun2的B16细胞中，促进细胞增殖的基因例如Cdk2，Cdc25c，Pcna和Mcm家族等基因表达下调，而阻滞细胞增殖基因Gadd45g，Gadd45b和Gadd45a表达上调(Fig. 6 C，D)。上述基因表达差异诠释了敲低Nsun2显著降低B16细胞DNA合成和增殖能力。

Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes (A) Prediction of differentially expressed genes KEGG pathway. (B) The top 20 KEGG pathways with significant enrichment of differentially expressed genes. (C) Clustering Heat Map of Differential Genes in Cell Cycle Pathway. (D) Clustering Heat Map of Differential Genes in DNA Replication Pathway

2.8 DEGs的表达验证

为验证RNA-Seq结果的准确性，从筛选获得的DEGs中随机选择表达上调和下调的基因进行RT-qPCR验证。与对照相比，Nsun2在实验组细胞中表达显著下调，同时10个上调基因和6个下调基因的表达情况与RNA-Seq结果一致(Fig. 7A,B)。进一步检测发现，敲低Nsun2显著下调周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases, CDK)CDK1和CDK2表达，而上调生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白GADD45A表达(Fig. 7C，D)。上述结果验证了转录物组筛选的关键DEGs表达量与实际表达水平一致。

Fig.7 Verification of differentially expressed genes via RT-qPCR and Western blot (A) Up-regulated gene expression quantification results. (B) Down-regulated gene expression quantification results. (C) The level of CDK1,CDK2,GADD45A protein was detected by Western blotting. (D) Quantitative analysis of Western blotting. GAPDH was used to normalize the variability in template loading. Data are presented as mean ± SD (n=3), and the statistical difference between two group were compared with a two-tailed student’s t test. *P < 0.05 compared to control

3 讨论

RNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，最近关于RNA甲基化的研究主要集中在mRNA的m6A修饰方面，但对m5C修饰知之甚少。太阳结构域家族蛋白成员2(Nsun2)，是典型的RNA甲基化转移酶，在靶基因成熟mRNA的编码区以及非编码区进行5-甲基胞嘧啶(m5C)化学修饰，提高靶基因的mRNA稳定性和翻译效率 。已有的研究表明，RNA m5C修饰参与肿瘤细胞的自我更新与分化，调控肿瘤细胞增殖与侵袭，例如胆囊癌和乳腺癌等[16]。但是，Nsun2在恶性黑素瘤细胞内的作用，目前为止尚不明确。本研究所构建的靶向Nsun2重组慢病毒RNA干扰载体，可有效降低Nsun2 mRNA和蛋白质表达水平，且EdU染色结果表明，稳定干扰Nsun2显著抑制B16细胞DNA合成，从而抑制黑素瘤细胞增殖。

本研究利用转录物组测序探索干扰Nsun2 的B16细胞全基因组表达水平，对差异表达基因进行GO和KEGG 通路富集分析。DEGs主要富集于细胞周期、DNA复制和细胞衰老等信号通路。RNA-seq和qPCR验证发现，调控细胞周期和DNA合成的相关基因Cdk2、Cdc25D、Ccna2均显著下调，而阻滞细胞增殖的Gadd45家族基因表达上调，说明NSUN2可能通过RNA甲基化影响DNA复制，调控细胞周期，促进癌细胞的增殖。

细胞周期是一个进化保守的过程，对细胞生长至关重要。细胞周期功能障碍是人类癌症发生的标志之一[17]。靶向细胞周期相关蛋白质是治疗癌症的主要临床手段。细胞周期蛋白依赖性激酶是调控真核细胞分裂周期的主要蛋白激酶[18]。Xing等[19]研究表明，人骨肉瘤细胞(U3OS)中，NSun2以细胞周期依赖性方式调节细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)表达。敲低NSun2降低了CDK1蛋白水平，抑制细胞增殖，而过表达Nsun2升高CDK1蛋白水平。进一步研究发现，NSun2甲基化CDK1 mRNA增强CDK1翻译效率，促进细胞增殖。Tang等[20]研究发现，敲低NSUN2的成纤维细胞中p27蛋白水平升高，CDK1表达降低，抑制了细胞增殖，加速细胞复制性衰老；当细胞过表达NSUN2，p27蛋白水平降低，CDK1表达上调，促进细胞增殖，延缓复制性衰老。本研究亦发现，干扰Nsun2基因抑制黑素瘤细胞增殖，转录物组筛选出差异表达基因中CDK1的mRNA和蛋白质水平也显著降低。由此本文推测，NSUN2主要通过调控CDK1表达水平，影响黑素瘤细胞增殖，是黑素瘤治疗的潜在靶点。

细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)主要负责细胞周期G1期向S期的转变，参与细胞增殖调控[21]。研究表明，多种肿瘤细胞的CDK2过度表达导致细胞周期的异常，促进了癌症的发生和发展[22]。Tang等[23]研究发现，沉默CDK2促进肿瘤抑制因子SIRT5的表达，CDK2是肿瘤治疗的潜在靶点。本研究表明，Nsun2敲低后黑素瘤细胞DNA合成减少，DEGs主要富集于细胞周期和DNA复制等方面，该现象与干扰Nsun2细胞中Cdk2表达下调相关，说明NSUN2可能通过调控CDK2表达水平影响黑素瘤细胞增殖。

嘌呤和嘧啶代谢与DNA复制过程中原材料dNTP供应相关。黄奕芝等[24]通过TCGA数据库分析和蛋白质免疫印迹发现，NSUN2在肝癌组织中高表达，敲低NSUN2后肝癌细胞增殖能力降低，差异表达基因主要富集于嘌呤和嘧啶代谢通路。该结果与本研究发现的干扰Nsun2后降低黑素瘤细胞DNA合成能力相似，说明NSUN2可能通过影响嘌呤和嘧啶的合成来调控癌细胞DNA复制能力。

生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白GADD45主要参与细胞周期阻滞和细胞凋亡。多项研究表明，黑素瘤细胞中，GADD45高表达能有效阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，但调控Gadd45表达的分子机制未知[25-26]。本文研究发现，Nsun2干扰的黑素瘤细胞中Gadd45基因表达明显上调，说明NSUN2是调控黑素瘤细胞Gadd45基因表达的关键因子之一，补充了Gadd45表达调控分子机制。

本研究对干扰Nsun2抑制小鼠黑素瘤B16细胞增殖相关信号通路进行了分析，并验证细胞周期相关差异表达基因，揭示了NSUN2在黑素瘤细胞中生物学功能，为黑素瘤治疗及靶向药物开发提供参考。