帕金森病患者血清circRNA DLGAP4和circRNA SAMD4A表达与病情严重程度及认知障碍相关性研究

柴琴琴，范磊，刘星亮，岳秉宏

帕金森病(Parkinson's disease，PD)可表现为运动迟缓、静止性震颤、嗅觉减退、认知障碍等，严重影响患者正常生活[1-2]。既往研究发现，PD发生发展与感染、氧化应激、炎性反应、环境、自噬、环状RNA(circular RNA，circRNA)异常表达有关[3-4]。circRNA作为一类环状非编码RNA分子，其在PD中表达失调，可作为诊断PD、评估PD严重程度的标志物[5]。近期研究显示，环状RNA DLGAP4(circRNA DLGAP4)作为circRNA家族的一员，其在PD中表达下调，circRNA DLGAP4可通过减少线粒体损伤、增强自噬，进而在PD中发挥神经保护作用[6]。另外，环状RNA SAMD4A(circRNA SAMD4A)在PD中呈高表达，其可能在PD发生发展中起促进作用[7]。基于上述研究，本研究通过测定circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A在PD患者血清中的表达水平，旨在分析其与PD严重程度、认知障碍的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年10月—2022年3月河北北方学院附属第一医院神经内三科收治的PD患者95例为PD组，男53例，女42例，年龄50～75(63.95±9.08)岁。并选择同期体检健康者95例为健康对照组，男50例，女45例，年龄50～75(62.37±8.74)岁。2组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(L2019-147)，全部受试对象及其家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①符合“中国帕金森病的诊断标准(2016版)”[8]中PD诊断标准；②初诊PD患者；③临床资料完善。(2)排除标准：①患有阿尔茨海默病、PD叠加综合征、血管性痴呆或其他严重精神疾病史者；②患有急慢性感染性疾病或伴有肝、肾功能不全者；③患有自身免疫性/内分泌代谢疾病、肿瘤者。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表达水平检测：收集PD患者确诊后24 h内及体检健康者体检当日空腹外周血5 ml，自然凝集离心留取血清，存于-80℃冰箱待测。解冻血清，使用Trizol试剂提取总RNA；之后，应用反转录试剂盒合成cDNA(Trizol试剂及试剂盒均购自上海慧颖生物科技有限公司)；最后利用PCR试剂盒和qRT-PCR仪将cDNA扩增，并确定循环阈值(CT)。扩增条件：98℃ 8 min，97℃ 20 s，64℃ 25 s，70℃ 10 s，40个循环。circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A均以GAPDH为内参基因，引物序列见表1。circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A相对表达量以2-△△CT法计算。PCR仪、PCR试剂盒及引物购自江苏弘麒生物科技有限公司。

表1 基因引物序列

1.3.2 临床症状评分与分组：对所有PD患者进行蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分[9]，根据评估结果将PD患者分为认知正常亚组54例(MoCA评分≥26分)和认知障碍亚组41例(MoCA评分<26分)。采用Hoehn-Yahr(H-Y)分期[10]评估所有PD患者严重程度，将其分为1期亚组33例、2～3期亚组44例、4～5期亚组18例。

2 结 果

2.1 组间血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表达水平及MoCA评分比较 与健康对照组比较，PD组患者血清circRNA DLGAP4表达水平、MoCA评分降低(P<0.01)，血清circRNA SAMD4A表达水平升高(P<0.01)，见表2。

表2 健康对照组、PD组血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A水平及MoCA评分比较

2.2 不同认知程度PD患者临床资料比较 认知障碍亚组PD患者年龄、血清circRNA SAMD4A表达水平高于认知正常亚组，而受教育年限、血清circRNADLGAP4表达水平、MoCA评分均低于认知正常亚组(P<0.05)，2亚组PD患者性别、饮酒、吸烟、高血压、糖尿病比例、PD家族史、PD临床分型比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 认知正常亚组与认知障碍亚组PD患者临床资料比较

2.3 不同严重程度PD患者血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表达水平及MoCA评分比较 1期亚组、2～3期亚组、4～5期亚组PD患者血清circRNA DLGAP4表达水平、MoCA评分依次降低(P<0.01)，血清circRNA SAMD4A表达水平依次升高(P<0.01)，见表4。

表4 不同严重程度PD患者血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表达水平及MoCA评分比较

2.4 PD患者血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表达水平与MoCA评分的相关性 Pearson法分析显示，PD患者血清circRNA DLGAP4表达水平与MoCA评分呈正相关(r=0.557，P<0.001)，血清circRNA SAMD4A表达水平与MoCA评分呈负相关(r=-0.598，P<0.001)。

2.5 多因素Logistic回归分析PD患者发生认知障碍的影响因素 以PD患者是否发生认知障碍为因变量(发生=1，不发生=0)，以年龄、受教育年限、circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示，受教育年限长、血清circRNA DLGAP4高是PD患者发生认知障碍的保护因素(P<0.01)，年龄大、血清circRNA SAMD4A高是其危险因素(P<0.01)，见表5。

表5 PD患者发生认知障碍的多因素Logistic回归分析

2.6 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A预测PD患者发生认知障碍的价值 绘制ROC曲线结果显示，血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A及二者联合诊断PD患者发生认知障碍的AUC分别为0.791、0.852、0.948，二者联合诊断的AUC优于血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A单独诊断(Z=2.950、2.081，P=0.003、0.037)，见图1、表6。

表6 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A对PD患者发生认知障碍的诊断价值

图1 血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A诊断PD患者发生认知障碍的ROC曲线

3 讨 论

PD是一种不可逆、呈进行性加重的神经退行性疾病，其病程长，通常给予对症治疗，多数患者在5～8年后生活几乎不能自理[10-13]。因此，寻找与PD病理发展相关，且可评估PD严重程度的标志物，对及时制定针对性治疗方案，延缓PD患者病情尤为重要。

circRNA结构稳定，能调控微小RNA表达，且可参与蛋白质翻译，与亨廷顿病、阿尔茨海默病、癫痫、PD等神经系统疾病关系密切[14-16]。研究发现，circRNA DLGAP4作为circRNA家族的成员之一，其在急性缺血性脑卒中(AIS)中呈低表达，circRNA DLGAP4可通过抑制神经炎性反应、氧化应激反应，进而减轻脑卒中损伤，circRNA DLGAP4可作为诊断AIS、评估AIS严重程度的潜在指标[17]。另外，Qiu等[18]研究认为，过表达circRNA DLGAP4可通过增加神经细胞活力，抑制神经细胞凋亡，降低炎性反应水平，从而缓解神经元损伤。本研究显示，PD患者血清circRNA DLGAP4表达水平较健康者低，与Feng等[6]研究趋势相符，提示circRNA DLGAP4表达水平降低可能与PD发生发展密切相关，推测circRNA DLGAP4可能通过影响氧化应激、神经炎性反应及神经细胞活力，进而影响PD进程。本研究发现，circRNA DLGAP4表达水平随PD患者病情加重而呈降低趋势，表明检测血清circRNA DLGAP4表达水平有利于临床评估PD患者病情，circRNA DLGAP4有望成为评估PD严重程度的血清指标。近期报道显示，circRNA SAMD4A在心肌梗死中表达水平升高，可通过促进细胞凋亡、炎性反应进而促进心肌梗死[19]。此外，Wang等[7]研究发现，circRNA SAMD4A可通过影响自噬，促进多巴胺能神经元凋亡，进而促进PD病理变化。本研究中PD患者血清circRNA SAMD4A表达水平较健康者高，与Wang等[7]研究趋势一致，且PD患者病情越严重，血清circRNA SAMD4A表达水平越高，提示其可能参与PD病变过程，且circRNA SAMD4A具有判定PD患者疾病严重程度的潜在价值，分析可能原因，circRNA SAMD4A可能通过促进多巴胺能神经元凋亡，影响机体自噬，从而影响PD疾病进展。本研究ROC曲线分析发现，血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A对PD患者发生认知障碍有一定诊断价值，可能是诊断PD患者发生认知障碍的潜在指标，且二者联合诊断可能更有利于临床判定PD患者发生认知障碍，为临床诊治PD认知障碍提供新方法。

认知障碍是PD患者中较为常见的一种非运动症状，MoCA评分是评估认知障碍的常用方法，其操作简便，易于理解[20-23]。本研究显示，PD患者MoCA评分较健康者低，且H-Y分期越高，MoCA评分越低，提示PD患者存在认知损伤，且MoCA评分可辅助判断PD严重程度。另外，经相关性分析发现，PD患者MoCA评分与血清circRNA DLGAP4表达水平呈正相关，与血清circRNA SAMD4A表达水平呈负相关，提示circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A可能与PD患者认知障碍有关。且本研究发现，发生认知障碍的PD患者受教育年限较短，年龄较大，血清circRNA DLGAP4表达水平、MoCA评分较低，血清circRNA SAMD4A表达水平较高，进一步提示血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A表达水平、受教育年限、年龄可能与PD患者发生认知障碍关系紧密[24-26]。此外，多因素Logistic回归分析发现，血清circRNA DLGAP4表达水平降低、circRNA SAMD4A表达水平升高、受教育年限较短、年龄较大均可能会增加PD患者发生认知障碍的风险，及时监控血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A等指标水平，对临床预防PD患者发生认知障碍甚是有益。

综上，PD患者血清circRNA DLGAP4表达下调，circRNA SAMD4A表达上调，两者表达水平与PD严重程度、认知障碍密切相关，有望成为临床评估PD患者病情、判断PD患者是否发生认知障碍的辅助指标。但本研究有一定局限性：纳入样本较少，且本研究尚未探究血清circRNA DLGAP4、circRNA SAMD4A与PD患者预后的关系，后期将扩大样本，进行跟踪随访，展开深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

柴琴琴：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写，进行统计学分析；范磊：课题设计，提出研究思路，分析试验数据，论文审核；刘星亮、岳秉宏：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改