高效液相-串联质谱法测定猪、牛和羊尿液中18种同化激素的含量

侯 轩，罗成江，王 彬，黄 娟，吴望君，任玉琴，陈 洁

(浙江省动物疫病预防控制中心，杭州 310000)

同化激素(Anabolic hormones)属于具有环戊烷并多氢菲母核的甾体激素类药物，由于其具有提高饲料转换率，加快动物蛋白质的沉积，促进畜禽生长的功效[1-3]，可以快速产生显著直接的经济效益，在畜牧业养殖中常常存在违规使用的情况。但该类药物在畜禽体内易蓄积残留[4]，人体摄入后会造成不同程度的危害[5-6]。自20世纪90年代开始，欧盟等西方发达国家对同化激素类药物残留进行了严格的限制[7]，为保障人民的身体健康和生命安全，保障畜牧业的健康持续发展，我国农业部176公告已经明确左炔诺孕酮、苯丙酸诺龙等同化激素类药物禁止在饲料和动物饮用水中使用。目前，国内外关于动物组织和尿液中同化激素检测方法研究已有报道，检测方法主要为气相色谱-串联质谱法[8-9]、液相-串联质谱法[10-12]等。本研究通过对仪器条件及前处理方法进行优化，拟建立可同时测定猪尿、牛尿、羊尿中18种同化激素HPLC-MS/MS检测方法，为保障畜产品质量安全提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 18种同化激素标准品(群勃龙、诺龙、勃地酮、雄烯二酮、睾酮、孕酮、雄烯醇酮、美雄酮、甲睾酮、甲氢睾酮、左炔诺孕酮、康力龙、丙酸诺龙、氟甲睾酮、达那唑、丙酸睾酮、醋酸甲羟孕酮和苯丙酸诺龙)、3种同化激素内标标准品(D3-甲睾酮、D9-孕酮、D3-睾酮标准品)均购于Witega公司，纯度≥90.0%；甲酸、甲醇、乙腈(色谱纯，默克公司)；乙腈(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；C18固相萃取小柱 (500 mg/6 mL，Waters公司)。

1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪(1290 Infinity，Agilent公司)串联三重四极杆质谱仪(QTRAP 5500，ABSCIEX公司)；电子天平(XS-205，Mettler公司)；电子天平(SL502 N，上海民桥精密科学仪器有限公司)；氮吹仪(N-EVAP，Organomation公司)；冷冻离心机(3-18k，Sigma公司)；振荡器(ZD-8500，华立达公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 仪器条件

1.3.1.1 色谱条件 用十八烷基键合硅胶色谱柱(Waters C18 3μ m 3.0×150 mm)，柱温30 ℃，进样量5 μL，0.2%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为0.3 mL/min。

表1 HPLC-MS/MS流动相条件Table 1 Mobile Phase Conditions of HPLC-MS/MS

1.3.1.2 质谱条件 电喷雾源正离子模式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；离子源电压：4500 V，辅助加热气温度：500 ℃，气帘气流速：10 L/h；离子源气流流速：Gas1为45 L/h，Gas2为45 L/h；18种同化激素类化合物及3种内标的MRM条件参数见表2。

1.3.2 标准溶液及标准曲线工作溶液配制

1.3.2.1 标准贮备液及内标贮备液配制(1.0 mg/mL) 分别精密称取18种激素类药物及3种内标药物标准品约10 mg(准确至0.01 mg)，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成1.0 mg/mL的激素类药物标准及内标贮备液。-20 ℃保存，有效期6个月。

1.3.2.2 混合标准中间液配制(1.00 μg/mL) 分别吸取适量的18种激素类药物的贮备液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，使之成1.00 μg/mL的混合标准中间液。4 ℃保存，有效期3个月。

1.3.2.3 混合内标中间液配制(1.00 μg/mL) 分别吸取适量的3种内标贮备液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，使之成1.00 μg/mL的混合内标中间液。4 ℃保存，有效期3个月。

1.3.2.4 标准曲线工作溶液配制 分别吸取适量的混合标准中间液，用50%乙腈溶液稀释成浓度为1.0、5.0、10.0、50.0、200.0 和500.0 μg/L的标准曲线溶液，临用新配。

表2 18种同化激素和3种内标多反应监测条件参数Tab 2 Retention time and MS parameters for analysis of 21 target compounds

1.3.3 样品前处理 取试样5.0 mL，置于10 mL离心管中，加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL，37.0 ℃(±0.5 ℃)下酶解16 h，取出冷却至室温后，用盐酸溶液(2.0 mol/L)或 氢氧化钠溶液(2.0 mol/L)调节pH值至7.0(±0.5)，于10000 r/min离心5 min，取上清液为备用液。

C18固相萃取柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取全部备用液过柱，控制流速在1.0 mL/min以下，用淋洗液5 mL淋洗，抽干。用8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40 ℃水浴条件下，氮气吹干，用50%乙腈水溶液适量溶解残余物，取适量溶液经0.22 μm过微孔滤膜，上机测定。

1.3.4 样品添加回收率、准确度和精密度测定 分别对猪、牛和羊尿液进行1.0、2.0、10.0 μg/L的18种同化激素空白添加回收实验，按1.3.3项前处理后进行HPLC-MS/MS检测。每个浓度设5个平行，连续做3 d，计算添加回收率、日内变异系数和日间变异系数。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化 同化激素属于脂溶性化合物，弱极性或中等极性，采用电喷雾电离(ESI)离子源，以0.1%甲酸水:乙腈:甲醇=1∶1∶1(V/V/V)为基准流动相，采用流动注射泵连续进样，对18种同化激素药物的质谱条件进行优化，在正离子模式下进行全扫描，以选择适当的分子离子峰和电离方式，确定了18种同化激素在多反应监测模式下信号采集的特征离子对(表2)。

2.2 液相条件的优化 由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离，因此流动相的组成和配比不但影响目标化合物的色谱行为，还会影响到目标化合物的离子化效率，从而影响灵敏度。本实验选择Waters C18柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)为分离柱，在正离子模式下，流动相中加入0.2%甲酸溶液，有利于化合物的离子化，通过梯度洗脱，确定了流动相比例和梯度条件。采用正离子模式监测18种同化激素类药物，并对离子源和气体的相关参数进行了优化，得到空白猪尿总离子流图，见图1；空白猪尿加标样品选择离子色谱图，见图2。由图1、图2中可以看出待测药物出峰的位置没有杂质干扰，18种同化激素实现了良好的基线分离及响应。

图1 空白猪尿总离子流图Fig 1 TIC of blank pig urine

2.3 固相萃取柱选择 在动物尿液试验中，由于同化激素极性较弱，在动物尿液检测同化激素方法中，选择反相固相萃取柱净化，并对以下两种萃取小柱进行试验比较：1、HLB(亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮大孔共聚物)规格：500 mg/6 mL；2、C18(烷基键合硅胶)规格：500 mg/6 mL。用以上两种小柱分别进行猪尿液回收率试验，添加浓度2.0 μg/L，5个平行样。经实验证明(表3)C18回收率整体水平较高，尤其是苯丙酸诺龙、丙酸诺龙回收率高于HLB，故采用C18小柱。

2.4 标准曲线、检出限及定量限 按1.3.3项处理空白样品后，高效液相色谱串联质谱检测，以峰面积作为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。由表4可知，在浓度为1～500 μg/L浓度范围内，线性关系良好，r2>0.99，取信噪比S/N=3的样品浓度为方法检出限(LOD)，取信噪比S/N=10的样品浓度为方法定量限(LOQ)。

表4 18种同化激素的线性方程相关相关系数Tab 4 Linear equation correlation coefficients of 18 anabolic hormones

2.5 方法的回收率、精密度 在1.0、2.0、10.0 μg/L浓度添加水平下进行添加回收实验，每个浓度设5个平行，重复3次。计算添加回收率及变异系数，结果见表5～表7。

表5 猪尿中18种同化激素的回收率(n=5)Tab 5 Recovery rate of 18 anabolic hormones in pig urine (n = 5)

表6 牛尿中18种同化激素的回收率(n=5)Tab 5 Recovery rate of 18 anabolic hormones in cattle urine (n= 5)

表7 羊尿中18种同化激素的回收率(n=5)Tab 6 Recovery rate of 18 anabolic hormones in sheep urine (n= 5)

2.6 实际样品检测 应用建立的分析方法，对浙江省内20家养殖场采集的50份动物尿液进行测定，其中1批次牛尿检出孕酮，含量为12.3 μg/L；3批次羊尿检出睾酮，含量分别为3.61、5.33、21.6 μg/L。该检测结果表明，本方法能满足对动物尿液中18种同化激素有效监控的需求。

3 讨论与结论

3.1 酶解条件的选择 同化激素在动物组织中常以原形药物存在，在动物尿液中部分同化激素却以葡萄糖醛酸结合的形态存在[13]。因此本研究采用β-葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶在37±0.5 ℃下酶解16 h进行处理，达到较好的效果。

3.2 样品前处理方法的优化 张怡[14]等针对猪血浆和尿液样品，采用乙酸乙酯提取、C18固相萃取小柱净化，对8种同化激素开展同时测定，定量限为1 ～1.5 μg/L，回收率在71.5%～92.3%之间；曹玉萍[15]等采用叔丁基甲醚和三氯甲烷提取马尿中的同化激素，浓缩提取后，内标法定量，定量限为0.5～50 μg/L，回收率在68.74%～120%之间。本研究通过比较不同pH值和固相萃取柱对待测物回收率的考察，确定了样品调节pH值至7.0(±0.5)直接过C18固相萃取柱的前处理方法，省去有机相提取步骤，减少了检测时间与成本，结果可见空白样品基线清晰，加标样品18种同化激素峰形锐利且无其他杂峰干扰，定量限为1.0 μg/L，回收率在79.2%～94.5%之间，满足检测要求。

本研究建立的动物尿液中18种同化激素HPLC-MS/MS检测方法，回收率在70.9%～112%之间，日内变异系数范围为1.2%～13.1%，日间变异系数范围为3.5%～16.7%，检测限为0.5 μg/L，定量限为1.0 μg/L。本方法操作简便，灵敏度高，适用于动物尿液中18种同化激素的同时测定。该方法优化了前处理条件，操作简便，检测方法灵敏度高，重现性强，符合兽药残留分析性能要求，可用于日常样品分析。