罕见类抗-A1抗体引起ABO血型正反定型不符多因素分析*

杨红梅，邹 昕#，虞 茜，许 飞，徐 立△

1.江苏省常州市中心血站,江苏常州 213000,2.江苏省常州市临床输血重点专科实验室,江苏常州 213000

ABO血型系统是最早被发现的人类血型系统，其基因位于第9号染色体，同时也是最重要的一个血型系统，在临床输血、移植医学和产前诊断中具有重要意义。在日常ABO血型鉴定工作中，常常会碰到正反定型不一致，在排除人为操作因素外，不规则抗体和亚型往往是研究者考虑的方向[1-3]。本实验室在ABO血型鉴定过程中发现1例正反定型不符标本，该标本血型血清学无法判断其血型，借助不规则抗体筛查、吸收放散试验、凝集抑制试验、酶处理试验、不同温度效价试验、溶血率监测等检测手段，并结合聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)基因分型和ABO基因第6、7外显子扩增产物基因测序，最后确定其血型为A101型。该病例为A型罕见的产生了类抗-A1抗体，目前国内少见其相关报道。

1 资料与方法

1.1一般资料 常某某，男，74岁，江苏常州人，汉族，2021年3月3日因肩骨疼痛入住常州市中医医院，术前常规备血过程中发现其鉴定正定型为A型，反定型为O型，正反定型不符，于当天送常州市中心血站输血研究室进行血型鉴定。

1.2仪器与试剂 抗-A/B单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20200609)、抗-D(IgM)单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20200301101)、抗-H抗体(德国CE公司，批号：OHM142)、抗-AB抗体(德国CE公司，批号：OABM083)、抗-A1抗体(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20200522)、ABO血型反定型红细胞(北京金豪制药股份有限公司，批号：2021101001)、人源抗-A/B单克隆抗体(自制)、血型分析液(上海血液生物医药有限责任公司，批号：20216201)、血型试剂质控试剂盒(上海申型医学科技有限公司，批号：20227202)、抗-Lea和抗-Leb抗体(德国CE公司，批号：OLeaM121-1和OLebM110-1)、抗体筛选细胞(匈牙利REAGENS公司,批号：702013)、微量游离血红蛋白(FHb)检测试剂盒(QuantiChrom公司，批号：210114)、ABO-PCR-SSP基因分型试剂盒(天津市秀鹏生物技术开发有限公司，批号：K202008006)、DNA提取试剂(美国Invitrogen公司，批号：15101)、琼脂糖(北京沃森生物科技有限公司，批号：181650)、溴化乙锭(10 mg/mL，青岛捷世康生物科技有限公司)。美国AB公司9700型PCR扩增仪、DNA浓度测定仪、凝胶成像系统、美国贝克曼库尔特的高速离心机、日本久保田的KA-2200型血清学专用离心机。37 ℃恒温水浴箱、湖南卢湘仪的TD4低速自动平衡离心机、北京瑞尔达生物科技有限公司的F4040半自动生化分析仪。

1.3血清学检测 采用试管法进行ABO正反定型试验。取B型献血者、O型献血者和患者红细胞少许，生理盐水洗涤3次，配制成2%红细胞悬液进行抗-H、抗-A1和抗-AB试验，离心判读凝集强度；同时对该标本进行抗体筛查。所有试验均严格按照《AABB技术手册(第18版)》[4]和文献[5]的方法及试剂操作说明书进行。

1.4PCR-SSP基因组DNA提取及ABO基因扩增、图谱比对分析 采用Invitrogen公司DNA提取试剂盒提取患者外周血基因组DNA，调整DNA模板浓度为30～35 ng/μL，A260/A280为1.60～1.80，根据人类ABO血型基因检测试剂盒说明书设置参数进行PCR扩增；取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析系统进行分析，并与天津市秀鹏生物技术开发有限公司提供的图谱比对分析结果。

1.5ABO基因测序分析和序列比对 ABO基因第6、7外显子扩增片段大小约为2 019 bp，扩增反应体系根据天津市秀鹏生物技术开发有限公司试剂盒说明书进行，采用引物：上游5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′；下游：5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。扩增产物经纯化后并测序，该试验部分在天津市秀鹏生物技术开发有限公司完成。第6外显子测序引物为上游：5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′；下游：5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′。第7外显子测序引物为上游：5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′；下游：5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。

2 结 果

2.1血型血清学检测结果 采用试管法对标本进行ABO血型血清学检测，正定型与抗-A凝集强度可达4+，与抗-B不反应。反定型患者血浆与A细胞(Ac)、B细胞(Bc)呈强凝集，与O细胞(Oc)和自身细胞(自身c)均不反应。进一步试验发现，H抗原表达强度很弱，与正常Bc几乎一致(正常O型抗-H凝集强度3+，正常B型抗-H凝集强度1+w/±)，与抗-A1、抗-AB呈4+凝集，排除A2亚型。为排除冷性不规则抗-A抗体，将反定型试管离心于37 ℃孵育15 min后再看结果，与Ac和Bc仍有凝集。为进一步鉴定是否存在同种抗体干扰血型，进行了抗筛试验，结果在盐水、凝聚胺、抗人球蛋白3种介质中均无凝聚、无溶血。以上试验排除了亚型、冷抗体及同种抗体等多因素干扰。

2.2试剂抗体或抗保养液抗体判断 将反定型试剂细胞经生理盐水洗涤3次后配成2%左右红细胞悬液(此时无保养液)进行血型血清学检测发现反定型Ac呈阴性，但换成血型稀释液即保养液后反定型Ac呈阳性(有无添加保养液对Oc和自身c均无影响)，见表1。

表1 患者血型血清学检测结果

2.3多细胞凝集判断 多凝集红细胞抗原是由于各种原因产生膜抗原暴露，从而导致多细胞凝集现象，这与临床疾病、人体免疫机制及红细胞免疫有关。为验证是否为多细胞凝集，整个试验过程参考《AABB技术手册(第18版)》进行，结果见表2。如果为多细胞凝集，则用酶处理患者细胞A抗原强度大大减弱，而正常A型红细胞A抗原强度不会减弱，患者红细胞经木瓜酶处理后A抗原强度并没有减弱，排除Tn多细胞凝集现象，说明正定型为A型。根据试验结果，排除多细胞凝集干扰。

表2 Tn多细胞凝集试验结果

2.4吸收放散试验 第1组取0.3 mL患者压积红细胞(Pc)与0.3 mL等量生理盐水56 ℃放散10 min；第2组取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清4 ℃吸收1 h即刻离心，冷盐水洗涤6次，加等量生理盐水56 ℃放散10 min；第3组取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清及2滴血型稀释液(保养液)4 ℃吸收1 h即刻离心，冷盐水洗涤6次，加等量生理盐水56 ℃放散10 min。试验过程中发现，第2组吸收后血浆呈溶血状态，即促发溶血反应并且A型红细胞在无保养液的情况下未能吸收抗-A抗体，所以吸收后血浆抗-A呈阳性而放散试验呈阴性。而第3组加血型稀释液(保养液)后抗-A能很好地被A细胞吸附，经56 ℃也能很好地放散下来，见表3。

表3 吸收放散试验结果

2.5不同抗凝剂的溶血率监测分析 在试验过程中发现，不同颜色的标本管溶血程度完全不同，紫管第2天出现了肉眼可见的溶血现象。连续10 d监测3种试管中血浆或血清FHb水平，结果见表4、图1。其中紫管抗凝剂为乙二胺四乙酸，绿管抗凝剂为枸橼酸钠，红管无抗凝剂。紫管与红管、绿管FHb水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 3种试管连续监测10 d FHb水平比较

注：与紫管比较，*P<0.05。

表4 3种试管中FHb水平比较(g/L)

2.6不同介质中Ac重悬液的抗体效价测定 取380 μL血清加20 μL质控液，加400 μL 2-Me混合于37 ℃水浴箱中破坏30 min，离心后取4滴破坏液和1滴Ac混合离心结果为阴性，说明破坏完全且该抗体为IgM型抗体。采用倍比稀释测定IgM抗体效价，结果见表5。结果显示，未加保养液的Ac和该抗体无凝集反应，加保养液后效价达到16，至少增强4管。

表5 不同介质中Ac重悬液的抗体效价测定

2.7唾液试验 收集患者唾液离心后用玻璃管煮沸10 min再次离心，取上清液备用。同时将抗-A、抗-B、抗-H稀释调整到2+的凝集强度，标好试管，先加抗-A、抗-B、抗-H 100 μL到试管中，阴性对照管加100 μL生理盐水，测试管加100 μL唾液，离心混匀置4 ℃ 1 h后加0.8%Ac、Bc和Oc，置4 ℃ 30 min，结果唾液中检测到A物质和H物质。进一步对患者红细胞Lewis系统抗原进行测定，表现型为Le(a-b+)，结合结果该患者为A型分泌型，说明该患者反定型抗体并非抗-ALeb抗体。

2.8ABO-PCR-SSP及基因测序 经ABO-PCR-SSP及第6、7外显子测序，以A101作为测序标准序列，患者第6、7外显子未见碱基替换和氨基酸替换，表现型为A1，基因测序为ABO*A1.01，见表6。

表6 患者ABO血型第6、7外显子核苷酸序列结果

3 讨 论

类同种抗体指类似于同种抗体性质的自身抗体，但不同于自身抗体。比如RhD(+)患者血浆中有类同种抗-D，该患者血浆中抗-D与其他所有人的RhD(+)红细胞均反应，但与自身红细胞不反应，这应该是同种抗体，但又和同种抗体不一样，所以将这样的抗体定义为“类同种抗体”。抗-A1有类同种抗-A1抗体，这种抗体除了不与自身红细胞反应外，能凝集所有A1细胞，与疾病、免疫应答和抗体三维结构改变有关[6]。抗-A1还可能受Rh相关糖蛋白的影响，有文献报道了1例很独特的抗-A1，它只凝集A型RhD+细胞，而且这例抗-A1与A1D+细胞反应强于A2D+细胞，同时这例抗-A1不与A1D-细胞反应，也不与O型D+细胞反应[6-7]。被认为是Rh相关蛋白影响了A1细胞在不同RhD(+/-)时与抗-A1的反应情况，可能是因为膜外抗原三维构象改变所致[8]。而抗-A1有类同种抗体，类同种抗-A1抗体可存在于A1型人血浆中，但与自身A1型红细胞不反应，可与其他人A1型红细胞反应，这种类同种抗-A1抗体在理论上属于自身抗体，但其分子生物学结构目前还缺少研究报道。

本病例在鉴定其血型过程中，排除了亚型、冷抗体及同种抗体等多因素的干扰，进一步考虑是否为试剂抗体或者抗保养液抗体导致血型不一致，或存在Tn多细胞凝集或异体抗-A抗体还是抗-ALeb抗体或抗-HA抗体或类抗-A1抗体等多因素，并通过相关血型血清学技术手段一一验证。在试剂抗体或者抗保养液抗体试验过程中发现，患者血浆中存在一种和A抗原特异性反应的抗-A抗体，该抗体可以被红细胞保养液增强，但也很容易被生理盐水洗脱，且亲和力不强。而抗保养液抗体一般反定型Ac、Bc、Oc都凝集(室温盐水弱凝集)、与自身c不反应、直接抗人球蛋白试验阴性、无冷抗体特性及能排除类同种抗体等特点，排除了并非为抗保养液抗体引起的正反定型血型不一致。同时，随机挑取3位健康A型献血者和3位健康O型献血者与本研究的患者进行交叉配血试验，本研究的患者血清与3位健康A型献血者用生理盐水配置的2%红细胞悬液在盐水和抗人球蛋白卡中均为阴性，而凝聚胺为阳性，这种情况通常发生在弱冷抗体情况下，但弱冷抗体被保养液明显增强的案例少见报道。本研究的患者血清与3位健康O型献血者用生理盐水配置的2%红细胞悬液配血在3种介质中均无凝集、无溶血。

总之，ABO血型鉴定极其重要，若存在正反定型不一致时，非常有必要采用血型血清学和分子生物学相结合的方法进行检测，以确保临床输血安全。